炎症与肝脂质代谢研究新工具丨THP-1 条件培养基诱导的 HepG2 细胞模型

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：HepG2 cells stimulated by THP-1-conditioned medium: a potential in vitro model of systemic inflammation–induced hepatic alterations

中文标题：THP-1 条件培养基刺激的 HepG2 细胞：一种潜在的系统性炎症诱导肝损伤体外模型

发表期刊：《Molecular Biology Reports》

影响因子：2.8

作者单位：

1.Department of Cell and Molecular Biology of Drugs, Faculty of Pharmacy, Comenius University, Bratislava 83232, Slovakia

2.Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Comenius University, Bratislava 83232, Slovakia

3.Department of Basic Sciences, University of Crete Medical School and Institute of Molecular Biology and Biotechnology, F.O.R.T.H, Heraklion GR-711 10, Greece

作者信息：

第一作者：Veronika Vyletelová

通讯作者：Ľudmila Pašková

研究背景

慢性炎症疾病与脂质和脂蛋白代谢的定性及定量变化相关，包括高密度脂蛋白(HDLs)的异常，会增加患者患动脉粥样硬化的风险和心血管疾病死亡率。肝脏作为脂蛋白代谢和系统性炎症调控的核心器官，其功能易受炎症信号影响，在急慢性炎症状态下会发生显著代谢改变。尽管已有研究采用单一细胞因子或脂多糖(LPS)刺激肝细胞构建炎症模型，但系统性炎症通常由多种循环细胞因子和介质协同作用引发，现有模型缺乏生理环境的复杂性。因此，本研究旨在开发并验证一种体外模型，通过将人肝癌 HepG2 细胞暴露于 THP-1 来源巨噬细胞的条件培养基(CM)，模拟体内炎症环境对肝脏脂质代谢的影响，为探究炎症驱动的肝代谢异常机制及相关治疗药物筛选提供可靠工具。

研究方法

本研究首先优化 THP-1 细胞刺激方案：将 THP-1 单核细胞以 0.9×10⁶ cells/mL 接种于 T25 培养瓶，经 10 ng/mL 佛波酯(PMA)诱导 24 小时分化为巨噬细胞，再用 1 μg/mL LPS 刺激 4 小时，随后更换无血清无补充剂的 RPMI 培养基继续培养 24 小时，收集条件培养基(CM)并经 0.22 μm 滤膜过滤，以 1:3 比例用无血清 RPMI 稀释后处理 HepG2 细胞;HepG2 细胞以 0.2×10⁶ cells / 孔接种于 12 孔板，24 小时后加入 CM，分别在不同时间点收集细胞用于后续实验。通过实时定量 PCR(qRT-PCR)检测炎症相关基因、转录因子及脂蛋白代谢相关基因的 mRNA 表达，Western blot 分析 ApoA1 和 PCSK9 蛋白表达，ELISA 测定 CM 中 TNF-α 和 IL-1β 的浓度，MTT 法评估 HepG2 细胞活力，DAPI 染色结合流式细胞术分析细胞周期，同时设置未刺激的 THP-1 细胞条件培养基(NS-CM)处理组作为对照，所有实验数据采用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，通过多重 t 检验(假发现率校正)或单因素方差分析结合 Tukey 多重比较检验判断差异显著性。

实验结果

图1：THP-1 细胞条件培养基(CM)制备流程示意图

该图清晰展示了 CM 的制备及实验设计流程：THP-1 单核细胞经 PMA(10 ng/mL，24 小时)诱导分化为巨噬细胞，再经 LPS(1 μg/mL，4 小时)炎症激活后，更换无血清培养基培养 24 小时收集 CM;将过滤后的 CM 以 1:3 比例稀释，加入 HepG2 肝细胞培养基中共同孵育，最终通过检测 HepG2 细胞的基因和蛋白表达变化，评估炎症环境对肝脂质代谢的影响，明确了实验的核心技术路径和分组逻辑。

图2：PMA+LPS 刺激对 THP-1 细胞炎症标志物基因和蛋白表达的影响

该图验证了 THP-1 细胞的炎症激活效果：a 图的 qRT-PCR 结果显示，PMA+LPS 联合刺激显著上调 THP-1 细胞中 NF-κB p50/p105、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达，证实炎症通路被成功激活;b 图的 ELISA 结果显示，激活后的 THP-1 细胞分泌的 CM 中，TNF-α 和 IL-1β 蛋白浓度显著高于未刺激组(未刺激组未检测到)，表明 CM 中含有高浓度的促炎细胞因子，为后续 HepG2 细胞的炎症刺激提供了基础。

图3：CM 对 HepG2 细胞活力、细胞周期及形态的影响

该图评估了 CM 的细胞毒性：a 图的 MTT 实验结果显示，经 CM 处理 24 小时后，HepG2 细胞活力与对照组相比无显著差异;b 图的细胞周期分析表明，CM 处理未引起 HepG2 细胞在 G0/G1 期、S 期和 G2 期的分布异常;c 图的光学显微镜观察显示，CM 处理后的 HepG2 细胞保持正常形态，无明显损伤迹象，证实该浓度的 CM 对 HepG2 细胞无细胞毒性，不会影响细胞的基本生理状态。

图4：CM 处理后 HepG2 细胞基因和蛋白表达的时间依赖性变化

该图呈现了 CM 对 HepG2 细胞关键分子表达的调控作用：a 图显示，CM 处理后 2-4 小时内，NF-κB p50/p105、TNF-α、A20 等炎症基因快速上调，血清淀粉样蛋白 A(SAA)mRNA 表达持续升高至 28 小时;b 图表明，转录因子 PPARα 和 LRH-1 的 mRNA 表达显著下调;c 图显示，LDLr mRNA 表达上调，PON1 mRNA 表达在 4 小时后持续降低，20-24 小时时 PCSK9、ApoA1、ABCA1 和 ApoC3 等脂蛋白代谢相关基因 mRNA 显著下调;d 图的 Western blot 结果证实，CM 处理 24 小时后，HepG2 细胞中 ApoA1 和 PCSK9 蛋白表达均显著降低，与 mRNA 表达趋势一致。

图5：未刺激的 THP-1 细胞条件培养基(NS-CM)对 HepG2 细胞基因表达的影响

该图通过对比 CM 与 NS-CM 的作用，明确炎症激活的必要性：a 图显示，处理 4 小时后，NS-CM 对 HepG2 细胞中 NF-κB p50/p105、TNF-α、A20、SAA、PPARα、LRH-1 等基因的 mRNA 表达无显著影响，仅轻微上调 LDLr 表达;b 图显示，处理 24 小时后，NS-CM 对 PON1、PCSK9、ApoA1、ABCA1、ApoC3 等脂蛋白代谢相关基因的 mRNA 表达也无显著调控作用，证实 HepG2 细胞的基因表达变化是由 THP-1 细胞经 PMA+LPS 激活后分泌的促炎因子介导，而非 THP-1 细胞本身分泌的基础因子导致。

研究结论

本研究成功构建了一种基于 THP-1 巨噬细胞条件培养基刺激 HepG2 细胞的体外模型，用于模拟系统性炎症诱导的肝脂质代谢异常。实验证实，经 PMA+LPS 激活的 THP-1 细胞分泌的条件培养基(CM)中含有高浓度的 TNF-α 和 IL-1β 等促炎因子，CM 处理 HepG2 细胞后，未影响细胞活力、周期和形态，但能快速激活炎症通路(上调 NF-κB、TNF-α 等基因)，同时调控转录因子(下调 PPARα、LRH-1)和脂蛋白代谢相关基因 / 蛋白的表达(上调 LDLr 和 SAA，下调 ApoA1、PON1、ABCA1、PCSK9 等)，这些变化与慢性炎症疾病患者的脂质代谢特征一致;而未激活的 THP-1 细胞条件培养基无此调控作用，进一步验证了模型的特异性。该模型模拟了体内炎症环境对肝脏的复杂影响，克服了单一细胞因子刺激模型的局限性，为深入研究炎症驱动的肝脂质代谢重塑机制，以及筛选改善炎症相关脂质异常的药物提供了可靠的体外工具。