泛素化 HDAg 通过 JAK/STAT 激活 CD8⁺T 细胞，抑制 HBV/HDV 共感染肝类器官病毒复制

丁型肝炎病毒(HDV)需与乙肝病毒(HBV)共感染，是最严重的病毒性肝炎，30%-70% 患者 5-10 年内进展为肝硬化，但现有治疗存在局限：PEG - 干扰素疗效低、患者依从性差，新型进入抑制剂(如 Bulevirtide)无法清除肝细胞内病毒。核心问题在于HDV 特异性 CD8⁺T 细胞反应不足，导致感染持续;同时，传统研究模型存在缺陷 —— 原代肝细胞培养功能易丢失、HepG2-NTCP 细胞与原代肝细胞差异大、动物模型(如小鼠)天然抵抗 HDV，肝类器官模型多依赖非 FDA 合规的 Matrigel，限制临床转化。本研究通过建立 FDA 合规的 HBV/HDV 共感染肝类器官，探究泛素化小 HDV 抗原(Ub-S-HDAg)如何通过调控树突状细胞(DC)和 CD8⁺T 细胞免疫反应抑制 HDV 复制，填补 “HDV 免疫治疗靶点” 与 “生理相关模型” 的双重空白。

来自中国上海交通大学医学院附属第六人民医院、英国帝国理工学院的团队在《Antiviral Research》发表题为Ubiquitinated hepatitis D antigen-induced CD8⁺T-cell responses inhibit HDV replication in HDV-infected liver organoids的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

1.HBV/HDV 共感染肝类器官构建

细胞分化：人诱导多能干细胞(iPSCs)分步分化为肝细胞样细胞(HLC)—— 经定型内胚层(DE)→肝内胚层(HE)→肝母细胞→HLC(21 天)，通过 qPCR(ALB、AFP、NTCP)和免疫荧光(HNF-4α、NTCP)验证肝特性;

支架培养：HLC 接种于倒置胶体晶体(ICC)支架(PEG 材料，FDA 合规)，8 天形成成熟肝类器官;

病毒感染：HLC-ICC 先感染 HBV(MOI=100 vge/cell，4% PEG+2% DMSO)，48 小时后超感染 HDV，qPCR 检测病毒载量，免疫荧光 / WB 验证 HBsAg、HDAg 表达。

2.Ub-S-HDAg 慢病毒构建与免疫细胞处理

载体构建：将 Ub-S-HDAg、S-HDAg(对照)克隆至慢病毒载体 pGWLV01-new，转染 DC(从健康人 PBMC 分离，GM-CSF+IL-4 诱导)，设空白载体(NC)、TNF-α(DC 成熟阳性对照)组;

免疫共培养：DC 与 T 细胞(PBMC 分离，CD3/CD28 激活)共培养 3 天，磁珠分选 CD8⁺T 细胞，流式检测 DC 成熟标志物(CD80/CD83/CD86)，ELISA 检测细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-12 等)，LDH 法测 CD8⁺T 细胞毒性。

3.机制验证与体内实验

转录组测序：分析 Ub-S-HDAg 组与 NC 组 CD8⁺T 细胞的差异基因，KEGG/GO 富集通路;

通路阻断：用 JAK2 抑制剂 AG490 处理，WB/qPCR 检测 JAK1/JAK2/STAT1/STAT4 及其磷酸化水平;

小鼠模型：AAV-HDV1.2 建立慢性 HDV 感染小鼠，尾静脉注射 Ub-S-HDAg 转染的 DC，检测肝内 HDAg 和血清 HDV RNA。

(2)关键结果

1.肝类器官模型有效模拟 HBV/HDV 共感染：HLC-ICC 高表达 NTCP(HDV 受体)，感染后 3 天检测到 HDV RNA，峰值达 10⁶ copies/mL(第 6 天)，且能分泌具有感染性的 HBV/HDV 颗粒，可二次感染 Huh7-NTCP 细胞。

2.Ub-S-HDAg 促进 DC 成熟：与 S-HDAg/NC 组相比，Ub-S-HDAg 组 DC 的 CD80(99.33% vs 23.93%)、CD83(25.00% vs 0.55%)、CD86(99.40% vs 0.57%)表达显著升高，形态上出现更多树突状突起。

3.Ub-S-HDAg 通过 JAK/STAT 激活 CD8⁺T 细胞：

转录组显示 Ub-S-HDAg 组 CD8⁺T 细胞中 JAK/STAT 通路显著富集(GSEA 富集 score=1.8);

WB 证实 Ub-S-HDAg 组 JAK1/p-JAK1、JAK2/p-JAK2、STAT1/p-STAT1、STAT4/p-STAT4 表达升高 2-3 倍，AG490 可完全阻断;

CD8⁺T 细胞功能增强：Ub-S-HDAg 组 IFN-γ(+60%)、IL-2(+55%)、IL-12(+45%)分泌增加，对 HDV 感染细胞的毒性率达 55.48%(E/T=1:20)，是 S-HDAg 组的 2 倍。

4.Ub-S-HDAg 抑制 HDV 复制：肝类器官中，Ub-S-HDAg 组 HDV RNA 载量较 NC 组降低 60%，HDAg 蛋白减少 50%，AG490 处理后抑制效果消失;小鼠模型中，Ub-S-HDAg 组血清 HDV RNA 降低 40%，肝内 HDAg 阳性细胞减少 35%。

实验结果

图 1：iPSCs 分步分化为 HLC

该图验证细胞分化有效性：(A)分化流程：iPSC→DE→HE→肝母细胞→HLC→ICC 支架;(B)qPCR：分化过程中多能基因(OCT4/NANOG)下降，肝基因(ALB、AFP、NTCP)升高，第 21 天 HNF-4α 表达达峰值;(C)明场图：细胞从圆形(iPSC)变为多边形(HLC);(D)免疫荧光：iPSC 高表达 NANOG/SOX2/OCT4，HLC 高表达 HNF-4α/ALB/AFP/NTCP。图示 iPSC 可成功分化为功能型 HLC。

图 2：HBV/HDV 共感染肝类器官构建与验证

该图确认模型可行性：(A-B)ICC 支架外观与类器官生长：HLC 从支架边缘向中心生长，8 天覆盖支架;(C-D)免疫荧光 / HE 染色：类器官中 NTCP、HBsAg、HDAg 共定位，HE 显示典型肝细胞形态;(E)病毒载量：HDV RNA 在第 6 天达 1.73×10⁶ copies/mL，28 天仍可检测;(F-H)WB：类器官表达肝标志物(HNF-4α、CYP3A4)和 HDAg，分泌的病毒可二次感染 Huh7-NTCP 细胞。图示肝类器官可支持 HBV/HDV 共感染与病毒复制。

图 3：Ub-S-HDAg 诱导 DC 成熟

该图展示 DC 活化效果：(A)DC 分离纯度：PBMC 分离的 DC 中 CD45⁺CD11c⁺细胞占 65.10%;(B)Ub-S-HDAg 转染：免疫荧光 / 流式证实 DC 中 Ub-S-HDAg(GFP 标记)阳性率 > 90%;(C)形态：Ub-S-HDAg 组 DC 形成悬浮细胞簇，树突突起更丰富;(D)流式定量：CD80/CD83/CD86 在 Ub-S-HDAg 组表达显著高于 S-HDAg/NC 组，接近 TNF-α 阳性对照。图示 Ub-S-HDAg 可有效诱导 DC 成熟。

图 4：Ub-S-HDAg 激活 CD8⁺T 细胞的 JAK/STAT 通路

该图解析机制：(A-B)转录组：火山图显示 4499 个差异基因，热图显示 JAK/STAT 相关基因上调;(C-D)KEGG/GO/GSEA：JAK/STAT 通路富集最显著(FDR<0.001);(E-G)WB/qPCR：Ub-S-HDAg 组 JAK1/JAK2/STAT1/STAT4 及其磷酸化水平升高，AG490 可阻断，mRNA 水平与蛋白一致。图示 JAK/STAT 通路是 Ub-S-HDAg 激活 CD8⁺T 细胞的核心通路。

图 5：Ub-S-HDAg 增强 CD8⁺T 细胞免疫功能

该图验证 CD8⁺T 细胞效应：(A)ELISA：Ub-S-HDAg 组 IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α 显著升高，IL-4/IL-10 无差异;(B)ELISPOT：Ub-S-HDAg 组 IFN-γ 分泌斑点数是 NC 组的 3 倍;(C-D)增殖与毒性：CCK-8 显示 Ub-S-HDAg 组 CD8⁺T 细胞增殖率升高 40%，LDH 法显示 E/T=1:20 时细胞毒性达 55.48%，AG490 可抑制。图示 Ub-S-HDAg 通过 JAK/STAT 增强 CD8⁺T 细胞的增殖与细胞毒性。

图 6：Ub-S-HDAg 抑制肝类器官中 HDV 复制

该图呈现抗病毒效果：(A)病毒载量：Ub-S-HDAg 组 HDV RNA 随时间持续下降，21 天较 NC 组低 60%，AG490 处理后下降幅度缩小;(B)HBsAg：各组无显著差异，排除对 HBV 的影响;(C-D)免疫组化 / 荧光：Ub-S-HDAg 组 HDAg 阳性区域减少 50%，效果接近 IFN-α 阳性对照。图示 Ub-S-HDAg 诱导的 CD8⁺T 细胞可特异性抑制 HDV 复制。

全文总结

上海六院与英国帝国理工团队在《Antiviral Research》发表研究，基于 FDA 合规的 PEG-ICC 支架构建 iPSC 来源 HBV/HDV 共感染肝类器官(可支持病毒复制与分泌)，发现泛素化 HDAg(Ub-S-HDAg)能促进 DC 成熟，通过 JAK/STAT 通路激活 CD8⁺T 细胞(增强细胞因子分泌与毒性)，在类器官和小鼠模型中均抑制 HDV 复制;局限性为模型仅维持 28 天、未用患者 iPSC 验证。