结合猪滋养层类器官（sTOs）与空间转录组，解析母胎界面细胞多样性及滋养层分化机制

猪胎盘为上皮绒毛膜型(无侵袭性，母胎血管间保留完整组织层)，其母胎界面存在独特的乳晕结构(areola，负责母源组织液转运)，但猪滋养层细胞异质性及分化机制尚不明确。现有模型(如 PTr2 细胞系)仅模拟早期滋养层，无法复现体内异质性，且缺乏体外模型研究母胎互作。本研究通过建立猪滋养层类器官(sTOs)，结合 Visium 空间转录组，解析猪母胎界面的细胞多样性、分化轨迹及细胞互作，填补猪胎盘体外研究的空白，为兽医生殖生物学及比较胎盘学提供工具。

来自美国杜克大学、北卡州立大学、普渡大学的团队在《PLOS Biology》(2025 年，Vol. 23)发表题为Defining cellular diversity at the swine maternal–fetal interface using spatial transcriptomics and organoids的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

猪滋养层类器官(sTOs)构建与培养：从足月猪胎盘分离组织，经胰蛋白酶 - 胶原酶两步消化获得滋养层祖细胞，用 Matrigel 包裹形成 “穹顶”，在 tTOM 培养基(含 EGF、FGF2、CHIR99021 等)中培养，5-7 天传代，可冷冻复苏;悬浮培养 48 小时实现极性反转( apical 面从内侧转向外侧)，模拟体内极性。

分子与空间解析：单细胞 RNA-seq 分析 3 株 sTOs 的细胞异质性;对妊娠 66 天猪母胎界面样本进行 Visium 空间转录组，定位 10 个细胞集群;免疫荧光验证标志物(增殖 marker MKI67、上皮 marker CK18、紧密连接 ZO-1);CellChat 分析细胞互作网络;Slingshot 分析 sTOs 分化轨迹;整合单细胞与空间数据，通过概率建模匹配 sTOs 集群与体内细胞类型。

功能验证：差异表达分析与 GO 富集验证 sTOs 与体内细胞的功能一致性;比较 sTOs 与猪胎盘组织、子宫组织、PTr2 细胞的转录组差异;检测 sTOs 对乳晕滋养层特异性功能(内体形成)与界面滋养层功能( focal adhesion、血管生成)的保留。

(2)关键结果

sTOs 可长期培养(>15 代)，保留胎儿来源(Y 染色体基因检测)，高表达滋养层标志物(KRT18、GATA3、CTSB)，无子宫或成纤维细胞污染(低表达 FOXA2、VIM)，极性可通过悬浮培养反转;单细胞 RNA-seq 显示 sTOs 含 5 个集群：增殖型滋养层(TOP2A+)、界面滋养层(CA4+、PAG2L4+)、乳晕滋养层(CTSL+，分 2 亚型)、炎症相关滋养层(CXCL8+)、COX 酶高表达滋养层;Visium 空间转录组将母胎界面分为 10 个集群，母方包括肌层(SMTN+)、子宫内膜(SLPI+)，胎方包括界面滋养层(PSGs+)、乳晕滋养层(Areola-1：CTSLhigh/SPINK4+;Areola-2：CTSLmed/MMP7+)，且发现 Areola-1 不与界面滋养层连续，可能为成熟亚型;整合分析显示 sTOs 集群与体内细胞高度匹配(如 sTO 集群 0 对应界面滋养层，集群 1/3 对应 Areola-2)，且保留核心功能(界面滋养层富集血管生成通路，Areola-2 富集内体通路);CellChat 证实 sTOs 与体内共享 28 条细胞互作通路(如 ANGPTL、CDH、AGRN)，界面滋养层为主要信号发送者，乳晕滋养层为接收者，模拟体内母胎互作;Slingshot 轨迹显示 sTOs 从增殖型滋养层分化为界面滋养层，最终分化为 Areola-2，关键基因(TOP2A 下调、GRN/ITM2C 先升后降、NUPR1 上调)与体内一致。

实验结果

图 1：猪滋养层类器官(sTOs)的建立与验证

该图展示 sTOs 构建核心流程与特性：(A)流程：足月胎盘消化→Matrigel 培养→sTOs 形成;(B-D)形态：Matrigel 中为致密球形(无中央腔，与人类类器官差异)，悬浮培养呈囊状;(E-G)免疫荧光：sTOs 表达增殖 marker MKI67、上皮 marker CK18、紧密连接 ZO-1(Matrigel 中内侧定位，悬浮后外侧定位);(J-K)转录验证：sTOs 含 Y 染色体基因(确认胎儿来源)，高表达胎盘标志物(如 PAGE4、CTSD)，低表达子宫 / 成纤维细胞标志物。图示证实 sTOs 的滋养层属性与极性可塑性。

图 2：sTOs 的单细胞异质性解析

该图揭示 sTOs 的细胞多样性：(A)UMAP 显示 5 个集群，分布一致 across 3 株 sTOs;(C-D)标志物表达：滋养层 marker(KRT7、GATA2)高表达，成纤维细胞 / 子宫 marker(VIM、FOXA2)低表达;(E-F)集群特征：集群 2(增殖型，TOP2A+)、集群 0(界面滋养层，SOX5+)、集群 1(Areola-2，OCLN+)、集群 3(炎症相关，CXCL8+)、集群 4(COX 酶高表达);(G)泛滋养层 marker CTSB/KRT18 均匀表达，证实均为滋养层亚型。图示明确 sTOs 的异质性，为后续匹配体内细胞奠定基础。

图 3：猪母胎界面的空间转录组解析

该图定位母胎界面的细胞分布：(A)流程：妊娠 66 天母胎界面样本→OCT 包埋→Visium 测序;(B-D)UMAP 与 H&E 匹配：10 个集群对应组织学结构，母方肌层(Myo-1/2)、子宫内膜(Endo)，胎方界面滋养层(IntTroph)、乳晕滋养层(Areola-1/2);(C-F)标志物定位：肌层高表达 SMTN，子宫内膜高表达 SLPI，界面滋养层高表达 PSGs，Areola-1 高表达 CTSL;(G-H)样本一致性：4 个样本集群比例相似，Areola-1 与界面滋养层不连续。图示首次实现猪母胎界面的空间转录组图谱，明确胎方细胞的组织学定位。

图 4：空间转录组发现的滋养层特异性标志物

该图筛选胎方细胞的专属 marker：(A-B)泛滋养层 marker CTSZ/CTSB 在界面与乳晕均高表达，界面滋养层专属 CA4/PAG2L4，Areola-1 专属 CCDC162/SPINK4，Areola-2 专属 MMP7/AGR2;(C)sTOs 中这些 marker 分集群表达，如 CA4 在集群 0 高表达，CTSL 在集群 1/3 高表达。图示为滋养层亚型鉴定提供特异性标志物，且验证 sTOs 保留亚型特征。

图 5：猪母胎界面的细胞互作网络

该图分析母胎信号交流：(A-B)肌层与血管为主要信号发送者，胎方滋养层信号较弱;(C)信号模式：母方以 OSTN/VEGF 信号为主，胎方以 HGF/EGF 信号为主;(D-L)关键通路：HSPG2(肌层→界面滋养层，促血管生成)、MK(乳晕→母方 / 胎方，促滋养层功能)、IL6(界面滋养层→子宫内膜，免疫调节)，且存在胎方内部互作(界面→乳晕)。图示揭示猪母胎界面的双向信号网络，为理解胎盘功能调控提供依据。

图 6：sTOs 与空间数据的整合匹配

该图建立 sTOs 与体内细胞的对应关系：(A-C)空间数据筛选胎方集群(IntTroph、Areola-1/2);(D-E)概率建模：sTO 集群 0 匹配 IntTroph(概率 > 0.8)，集群 1/3 匹配 Areola-2，集群 4 匹配 Areola-1;(F-G)共享标志物：sTO 集群 0 与 IntTroph 共享 AKR1B1/TGM2，集群 1 与 Areola-2 共享 CTSA/NUPR1;(H)集群比例：sTOs 各亚型比例与体内一致。图示证实 sTOs 可模拟体内滋养层异质性，为体外研究提供有效性依据。

图 7：sTOs 的分化轨迹分析

该图追溯滋养层分化路径：(A)Slingshot 轨迹：从增殖型滋养层(ProfTroph)→界面滋养层(IntTroph)→Areola-2，为单一分化路径;(B-C)基因动态：增殖基因(TOP2A、HMGB2)随分化下调，界面特异性基因(GRN、ITM2C)先升后降，Areola-2 特异性基因(NUS1、NUPR1)终末上调;(D-F)空间验证：这些基因在体内对应细胞中表达模式一致(如 GRN 在界面滋养层高表达)。图示明确猪滋养层的分化顺序，为研究分化调控提供体外模型。

图 8：sTOs 与体内的细胞互作对比

该图验证 sTOs 对体内互作的保留：(A)Venn 图：sTOs 与体内共享 28 条滋养层互作通路;(B)信号强度：界面滋养层均为主要发送者，乳晕为接收者;(G-N)关键通路：ANGPTL(自分泌 / 旁分泌，整合素介导)、CDH(乳晕自分泌，界面无自分泌)、AGRN(界面专属，DAG1 为受体)在 sTOs 与体内模式一致。图示证实 sTOs 可复现体内滋养层互作，具备生理相关性。

全文总结

本研究的核心贡献在于：1. 建立首个可长期培养、极性可控的猪滋养层类器官(sTOs)，高保真模拟体内滋养层异质性;2. 首次绘制猪母胎界面的空间转录组图谱，鉴定 10 个细胞集群及乳晕滋养层的 2 个功能亚型;3. 整合单细胞与空间数据，明确 sTOs 集群与体内细胞的对应关系，证实其保留核心功能(内体形成、血管生成)与细胞互作通路(ANGPTL、CDH);4. 揭示猪滋养层从增殖型→界面→乳晕的分化轨迹，为胎盘发育研究提供新机制。局限性包括：Visium 空间分辨率无法达到单细胞水平，仅分析妊娠 66 天样本(缺乏多时序动态);未来需结合更高分辨率空间技术(如 STORM)及不同妊娠阶段样本，优化 sTOs 的成熟度(如模拟 syncytiotrophoblast 形成)。该研究为猪生殖健康、胎儿发育及比较胎盘学提供关键工具，也为人类胎盘研究提供参考(如乳晕与人类胎盘转运结构的进化关联)。