突破传统认知！网织自噬受体 FAM134C 跨界抑制 BMP 信号通路

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：Reticulophagy receptor FAM134C restrains BMP receptor signaling

中文标题：网织自噬受体 FAM134C 抑制 BMP 受体信号通路

发表期刊：《The EMBO Journal》

影响因子：8.3

作者单位：

1.MOE Key Laboratory of Biosystems Homeostasis & Protection and Zhejiang Key Laboratory of Molecular Cancer Biology, Innovation Center for Cell Signaling Network, Life Sciences Institute, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310058, China

2.Center for Life Sciences, Shaoxing Institute, Zhejiang University, Shaoxing, Zhejiang 321000, China

3.Cancer Center, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310058, China

4.State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, Innovation Center for Cell Biology, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen, Fujian 361005, China

作者信息：

Shuchen Gu、Hanchenxi Zhang，Xin-Hua Feng*(* 为通讯作者)

研究背景

FAM134/RETREG 家族是内质网自噬(ER-phagy)的关键受体，通过调控内质网周转维持细胞稳态，其中 FAM134A、B、C 虽功能部分重叠，但各自的非内质网自噬功能尚不明确。骨形态发生蛋白(BMP)属于 TGF-β 超家族，通过与 I 型(如 BMPR1A)和 II 型受体结合激活 Smad 信号通路，调控组织稳态、发育及疾病进程，其信号强度严格依赖受体的可用性和活性。目前已知 BMP 受体可通过泛素 - 蛋白酶体系统降解，但自噬 - 溶酶体途径对其调控的机制尚未阐明。因此，研究人员探究了 FAM134C 是否通过非内质网自噬功能调控 BMP 信号通路，揭示其在受体降解及生理病理过程中的作用。

研究方法

以 U2OS、HEK293T、A549 等细胞为体外模型，构建 FAM134C 敲除(KO)和过表达稳定细胞系;通过免疫共沉淀(Co-IP)、质谱分析验证 FAM134C 与 BMPR1A 的相互作用;采用 Western blot、qRT-PCR 检测 BMPR1A 及下游 Smad1/5/8 磷酸化水平、靶基因(Id1、Id2)表达;利用自噬抑制剂(氯喹 CQ、3-MA)和敲低自噬关键基因(ATG5、Beclin1)验证降解途径;通过 RUSH 系统、亚细胞分离、活细胞成像追踪 BMPR1A 的转运和降解定位;构建 FAM134C LIR 结构域突变体(FAM134C-mLIR、FAM134C-ΔLIR)，验证与 LC3 的相互作用对受体降解的必要性;以 FAM134C KO 小鼠为体内模型，结合免疫组织化学、肠道类器官培养，探究 FAM134C 对肠道 BMP 信号及隐窝再生的影响。

实验结果

图1：FAM134C 通过自噬途径降解 BMPR1A

(A、B)Id1-luc 报告基因实验显示，氨基酸剥夺或 mTOR 抑制剂(Torin1、雷帕霉素)可抑制 BMP 信号，mTOR 激活剂(MHY1485)则增强信号;(C、D)Western blot 证实，mTOR 抑制可降低 BMPR1A 蛋白水平，减少 Smad1/5/8 磷酸化;(E)Co-IP 结合质谱筛选出 BMPR1A 相互作用蛋白 FAM134C，过表达 FAM134C 可降低 BMPR1A 蛋白水平，且该效应可被自噬抑制剂 CQ、3-MA 逆转，蛋白酶体抑制剂 MG132 无影响;(F)FAM134C 过表达细胞中，内源性 BMPR1A 水平降低，CQ 可阻断该降解，雷帕霉素则增强降解，同时 BMP 诱导的 Smad1/5/8 磷酸化被抑制;(G)FAM134C KO U2OS 细胞中，BMPR1A 水平升高，Smad1/5/8 磷酸化及 Id1 表达增强;(H)敲低 ATG5 或 Beclin1 可阻断 FAM134C 介导的 BMPR1A 降解及 Smad1/5/8 磷酸化抑制;(I)免疫荧光显示，过表达 FAM134C 可促进 BMPR1A 与溶酶体共定位，证实其通过自噬 - 溶酶体途径降解。

图2：FAM134C 靶向膜结合型 BMPR1A 而非内质网新生受体

(A-C)RUSH 系统实验显示，生物素释放后(BMPR1A 从内质网转运至细胞膜)，FAM134C 可降低 BMPR1A 水平，而内质网滞留的 BMPR1A 不受影响;(D-F)BONCAT 实验和环己酰亚胺(CHX)阻断实验证实，FAM134C 不影响新合成 BMPR1A，仅加速成熟 BMPR1A 降解;(G)亚细胞分离显示，FAM134C 降解细胞膜和内体定位的 BMPR1A，对内核糖体(ER)中的 BMPR1A 无影响，HCQ 可促进 BMPR1A 在溶酶体蓄积;(H)网格蛋白介导的内吞抑制剂(氯丙嗪)、小窝蛋白介导的内吞抑制剂(制霉菌素)及高渗蔗糖可阻断 FAM134C 对 BMPR1A 的降解，证实其靶向内化后的膜结合型受体;(I)活细胞成像显示，FAM134C 将膜结合型 BMPR1A 靶向转运至溶酶体降解。

图3：FAM134C 与 BMPR1A 直接相互作用

(A)内源性 Co-IP 证实 FAM134C 与 BMPR1A 在多种细胞中存在相互作用，FAM134C KO 细胞中该相互作用消失;(B)外源性 Co-IP 显示，FAM134C 可与 BMPR1A 结合，不与 BMPR2 或 Smad5 相互作用;(C)片段结合实验证实，FAM134C 与 BMPR1A 的胞内域(ICD)结合，不结合胞外域(ECD);(D)体外翻译实验证实 FAM134C 与 BMPR1A 直接相互作用;(E)双分子荧光互补(BiFC)实验显示，FAM134C 与 BMPR1A 在细胞质中形成荧光复合物;(F)免疫荧光显示，FAM134C 与 BMPR1A 在细胞内呈点状共定位;(G、H)活细胞成像显示，饥饿条件下，FAM134C-BMPR1A 复合物与溶酶体(LysoTracker 标记)和自噬体(LC3 标记)的共定位增强。

图4：FAM134C 依赖 LIR 结构域招募 BMPR1A 至自噬体

(A)BiFC 实验显示，FAM134C 与 LC3 存在相互作用;(B)饥饿条件下，FAM134C-BMPR1A 复合物与 LC3 标记的自噬体共定位;(C)Co-IP 证实，FAM134C 可促进 BMPR1A 与 LC3 的相互作用;(D)构建 FAM134C LIR 结构域突变体(mLIR：DDFELL→AAAAAA;ΔLIR：缺失 LIR)，突变体无法与 LC3 结合，虽仍能与 BMPR1A 相互作用，但丧失降解 BMPR1A 的能力;(E、F)免疫荧光和 Western blot 证实，突变体无法定位于自噬体，在 FAM134C KO 细胞中过表达后，无法抑制 BMPR1A 水平及 Smad1/5/8 磷酸化。

图5：FAM134C 抑制 BMP 信号并调控肠道稳态

(A、B)FAM134C 过表达可抑制 BMP 诱导的 Id1、Id2 mRNA 和蛋白表达，FAM134C KO 则增强该表达;(C、D)FAM134C KO 小鼠小肠和结肠中，BMPR1A 蛋白水平升高，Smad1/5/8 磷酸化增强，且 BMPR1A 在隐窝底部异常表达(正常仅在绒毛顶部表达);(E)FAM134C KO 小鼠小肠隐窝中，干细胞标志物 Sox9 表达降低，杯状细胞标志物 Muc2 和肠内分泌细胞标志物 ChgA 表达升高;(F、G)饥饿处理后，野生型小鼠肠道 BMPR1A 水平降低，FAM134C KO 小鼠则无明显变化，证实 FAM134C 介导饥饿诱导的 BMPR1A 降解;(H-J)10 Gy X 射线照射后，FAM134C KO 小鼠肠道隐窝再生延迟，Ki67 和 Sox9 阳性细胞数量减少，干细胞再生能力受损。

图6：FAM134C 缺失通过增强 BMP 信号抑制肠道类器官形成

(A)FAM134C KO 小鼠肠道类器官生长受限，芽体数量显著减少，约 80% 无芽体形成;(B-D)FAM134C KO 类器官中，BMPR1A 水平升高，Id1、Id2 mRNA 表达增强，干细胞标志物 Lgr5、Olfm4 表达降低;(E-H)增加 BMP 拮抗剂 Noggin 浓度可剂量依赖性逆转 FAM134C KO 类器官的生长缺陷，恢复 Lgr5 表达并抑制 Id1 表达;(I)机制示意图：FAM134C 通过 LIR 结构域与 LC3 结合，将膜结合型 BMPR1A 招募至自噬体降解，从而抑制 BMP-Smad 信号通路，调控肠道干细胞稳态。

研究结论

本研究揭示网织自噬受体 FAM134C 的非内质网自噬功能：通过直接结合 BMP I 型受体 BMPR1A，依赖其 LC3 相互作用域(LIR)将受体招募至自噬体，经自噬 - 溶酶体途径降解，进而抑制 BMP-Smad 信号通路。FAM134C 特异性靶向膜结合型成熟 BMPR1A，不影响内质网新生受体;LIR 结构域突变或自噬关键基因敲低可阻断该降解过程。体内实验证实，FAM134C KO 小鼠肠道中 BMPR1A 蓄积，BMP 信号过度激活，导致肠道干细胞标志物表达降低、辐射损伤后隐窝再生延迟;体外类器官实验显示，增加 BMP 拮抗剂 Noggin 可逆转 FAM134C 缺失导致的生长缺陷。该研究首次阐明 FAM134C 通过自噬降解 BMP 受体调控信号通路的分子机制，揭示其在肠道稳态维持中的关键作用，为 BMP 信号异常相关疾病提供潜在治疗靶点。