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ATCC细胞培养
心脏是脊椎动物身体中最重要的一个器官,主要功能是为血液流动提供压力,把血液运行至身体各个部分。心肌细胞分离自心脏组织,呈菱形、多边形等不规则形状;细胞培养2h后开始贴壁,呈梭形;到12h左右,细胞开始伸出伪足,呈菱形、多角形;细胞分离培养48h以后,大部分伸出伪足、呈巴掌状,部分心肌细胞会出现搏动。体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点,并具有自发性节律搏动,且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素的影响等特点。利用培养的心肌细胞在探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节,研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血预处理、信号通路、对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子等方面具有广阔的应用前景,对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。
该试剂盒适用于Sprague-Dawley、Wistar-Imamichi等不同品系的新生0-3天大鼠原代心肌细胞提取试剂盒。
本试剂盒规格为5次(以3-5只新生大鼠为1次计)
2-8 ℃保存与运输,保质期为参考下表。所有组分开封后,有效期为 6-8 周,建议尽快使用。
表1. 分离培养试剂盒组成信息
产品名称 | 产品规格 | 储存条件 |
大鼠心肌细胞组织专用消化液I | 50 mL | -20°C,避光保存,3 个月 |
大鼠心肌细胞组织专用消化液II | 30 mL | -20°C,避光保存,3 个月 |
大鼠心肌细胞组织消化终止剂 | 10 mL | 2-8°C,避光保存, 3 个月 |
组织处理缓冲液 | 500 mL | 2-8°C,避光保存,3 个月 |
大鼠心肌细胞清洗液 | 100 mL | 2-8°C,避光保存,3 个月 |
0.1%明胶 | 30 mL | -20°C,避光保存,3 个月 |
大鼠心肌细胞纯化培养基I | 100 mL | 2-8°C,避光保存,3 个月 |
大鼠心肌细胞纯化培养基II | 100 mL | 2-8°C,避光保存,3 个月 |
大鼠心肌细胞纯化培养基III | 100 mL | 2-8°C,避光保存,3 个月 |
大鼠心肌细胞专用培养基 | 500 mL | 2-8°C,避光保存,3 个月 |
实验前准备:大鼠心肌细胞组织专用消化液I、II、组织处理缓冲液、大鼠心肌细胞纯化培养基I、II、III、心肌细胞专用培养基;实验需自备PBS、70μm细胞筛、手术器械、6cm/10cm培养皿、离心管若干。
一、大鼠心肌细胞提取:下面以新生1天Wistar-Imamichi大鼠为例。
大鼠心肌细胞分离D1(第一天所有操作在冰上进行)
1.准备新生乳鼠(0-3d)5只,使用异氟烷将乳鼠麻醉,麻醉后放到10 cm细胞培养皿盖上,喷酒精后放置超净工作台中。
2.用灭菌工具取出跳动的心脏,并将心脏放入50 mL离心管中的30mL预冷的组织处理缓冲液中(尽快取出心脏并立即将它们放在冰上,从身体上取出心脏后,所有步骤都应在冰上进行)。
3.五个心脏放入同一个离心管,旋转离心管清洗心脏组织,清洗后转入新的装有30 mL预冷的组织处理缓冲液中的离心管中继续清洗。
4.转入安全柜,去除上清,将心脏组织转入装有预冷的组织处理缓冲液的10 cm培养皿,小心吸取,注意不要吸出心脏。使用器械去除大血管及结缔组织等。
5.完成以上步骤,将组织转入新的装有预冷的组织处理缓冲液的10 cm培养皿,置于冰上,使用手术剪取心室部分(心室约占心脏的2/1~1/3),剪成小于1mm3组织块。
6.加入预冷的5 mL大鼠心肌细胞组织专用消化液I重悬组织块,4℃过夜消化。
大鼠心肌细胞分离D2
1.0.1%明胶包被培养皿,以6cm板为例,每孔加入2-3mL明胶溶液,置入37℃培养箱孵育,两小时,去除明胶溶液,PBS清洗1-2遍即可使用。
2.将过夜消化的心脏组织消化液全部转入50 mL离心管,加入1mL大鼠心肌细胞组织消化终止剂,37℃培养箱孵育30分钟。
3.加入5 mL大鼠心肌细胞组织专用消化液II,置于培养箱170-220 rpm消化45min。
4.使用移液器以3mL/S的速度吹打20次(来回记为一次),随后静置3分钟。取上清过70μm细胞筛。
5.剩余的组织进行充分研磨,继续加入5 mL的大鼠心肌细胞清洗液冲洗离心管,再次过70μm细胞筛,收集到同一个离心管中。随后用2 ml的大鼠心肌细胞清洗液清洗细胞筛。
6.室温放置20-60分钟消化剩余的细胞团快。
7.100xg,离心5 min,去上清。
8.使用20 mL大鼠心肌细胞纯化培养基I重悬细胞,将细胞悬液铺于1个10 cm培养皿中,放入培养箱培养1小时。
9.轻轻地旋转培养皿,收集10cm培养皿中的上清,上清为大鼠心肌细胞。(大多数大鼠心肌细胞在孵育1小时后仍会漂浮在上清液中。为了避免被轻微附着在培养皿上的成纤维细胞污染,不要通过移液来收集上清液。)
10.100 xg 离心5 min,使用2ml大鼠心肌细胞纯化培养基II重悬细胞,计数,将细胞悬液接种于明胶包被的六孔板中(2x105/孔),37℃,5%CO2培养箱培养,24小时内勿挪动细胞。
11.24小时后换液,更换大鼠心肌细胞纯化培养基III。
12.24小时后换液,更换大鼠心肌细胞专用培养基,后续每2-3天换液。
1. D1天全程建议在冰上操作,分离大鼠心肌细胞时应避免过度消化、过度重悬等操作导致细胞损伤。
2. 大鼠心肌细胞为终末分化细胞,在体外不增殖。
3. 大鼠心肌细胞消化液避免反复冻融,建议分装成小份保存,近期使用可保存于4℃。
4. 大鼠心肌细胞专用消化液、培养基中含有微生物生长所需的营养成分,请在超净工作台内打开,按照所需要量分装,并且用封口膜封住瓶口,即取即用,以避免污染。
产品规格:1*10^6
产品规格:1*10^6
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产品规格:1*10^6
产品规格:1*10^6
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