小鼠角质形成细胞分离试剂盒

产品描述

小鼠角质形成细胞(Keratinocytes)是表皮的主要组成细胞，占表皮细胞的90%以上，起源于外胚层，在皮肤屏障功能、伤口修复和免疫防御中发挥关键作用。这些细胞通过不断增殖、分化和角化，形成表皮的基底层、棘层、颗粒层及角质层，最终分化为无核的角质细胞并脱落，完成皮肤更新(约2-4周)。该细胞表达特征性标志物(如角蛋白K5/K14、K1/K10)，并参与分泌炎症因子(IL-1α、TNF-α)和结构蛋白(丝聚合蛋白、兜甲蛋白)。研究中常分离自新生小鼠皮肤或永生化细胞系(如HaCaT)，用于皮肤发育、疾病(银屑病、皮炎)及药物渗透实验。体外培养时需钙离子调控其分化，并依赖EGF等生长因子维持活性。因其与人类角质形成细胞高度相似，小鼠模型成为皮肤病机制和治疗研究的重要工具。

适用范围

该试剂盒适用于C57BL/6J、BALB/c等不同品系的小鼠角质形成细胞提取。

规格

本试剂盒规格为5次(以1只小鼠为1次计)

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表。试剂开封后，有效期为 6-8 周。

配套培养基信息

表1. 分离培养试剂盒组成信息

分离步骤

实验前准备：小鼠角质形成细胞分离试剂盒(小鼠角质形成细胞组织专用消化液I、II，鼠尾胶，小鼠角质形成细胞组织处理缓冲液、小鼠角质形成细胞专用培养基);实验需自备手术器械、6孔/6cm培养皿、离心管若干。

一、小鼠角质形成细胞提取：下面以1只C57BL/6J小鼠为例

D1：

1. 安乐处死新生0~3D小鼠，用剪刀剪去头部、四肢、尾巴。

2. 剥离整个皮肤：首先将锋利的剪刀插入尾部的孔中，然后沿着背部中线剪开身体皮肤到脖子上的开口，接下来，用一个镊子抓住暴露的身体，另一个镊子抓住皮肤，轻轻地将整个皮肤从身体上剥落，并在腿残端上连续移动。

3. 在6cm2培养皿中用组织处理缓冲液漂洗皮肤，重复漂洗3次，将幼鼠的皮肤放入装有冰冷的3~5mL小鼠角质形成细胞专用消化液I的15mL离心管中，封口后将其置于4℃冰箱中孵育过夜14~18小时。

(注：专用消化液I用量取决于实验者取下的小鼠幼鼠皮肤大小，若皮肤较大，可以剪成两张分为两管进行消化，应尽可能让皮肤在专用消化液I中展开，避免折叠，以达到完全暴露)

D2：

1. 预包被培养皿：用适量鼠尾胶包被6cm2皿30min，吸弃鼠尾胶，用PBS清洗培养皿3次，此时经包被的培养皿可直接使用

2. 消化14-18小时后，将皮肤与专用消化液I一起转移到培养皿中。将皮肤转移到带有组织处理缓冲液的新培养皿，可洗去多余的专用消化液I

3. 用两把镊子，从组织处理缓冲液中抓住皮肤，提起皮肤，转移到新的培养皿中，表皮面朝下，真皮面朝上，小心地拉伸皮肤褶皱，使其完全伸展在培养皿上

4. 将 1mL 专用消化液II放入新的培养皿中，使用镊子慢慢地向上提起真皮并远离表皮，同时按住表皮。

5. 转移分离得到的表皮，使其漂浮在专用消化液II上，将表皮剪碎成1cm2大小的组织块，室温下摇晃消化20min

6. 在培养皿中加入冰冷的3mL小鼠角质形成细胞专用培养基，使用移液器轻轻上下移液几次，以吹散任何细胞团块，镜下观察是否有细胞脱落。

7. 用100μM细胞筛过滤至50mL离心管中，再用2mL专用培养基冲洗皿底及100μM细胞筛，重复两次

8. 离心：过滤后的细胞以180 xg 离心5分钟

9. 吸出上清液并将细胞沉淀轻轻重悬于1 mL冷的专用培养基中

10. 计数

11. 以 5 x 104 /cm2的密度接种预先包被鼠尾胶的培养皿中

12. 等到有细胞贴壁后更换新鲜培养基(一般24小时即贴壁)，并每1~2天更换培养基，直到细胞达到所需实验前的汇合度

注意事项

1. 建议全程分离操作过程在冰上进行，可提高细胞活性。

2. 剥离小鼠皮肤时，需将皮肤作为一个完整的部分剥离，注意不要将皮肤分解成碎片，因为这会导致细胞在分散过程中丢失。

3. 小鼠建议使用出生0~3天的乳鼠，长毛的小鼠会增加污染的风险。

4. 小鼠角质形成细胞专用消化液、培养基中含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。