小鼠脾脏CD3+T细胞分离试剂盒（阴选）

产品描述

脾脏是机体重要的淋巴器官，内含多种重要的免疫细胞，其中CD3+ T细胞含量在35%以上，小鼠脾脏CD3+ T细胞分离试剂盒可通过阴性分选法从小鼠脾脏中分离纯化出CD3+ T细胞，纯化后可用于进一步进行培养扩增或者直接进行各种免疫学实验。

适用范围

本试剂盒适用于分离小鼠脾脏中的CD3+ T细胞。

规格

本试剂盒规格为10/25/50次(以1*10^7单细胞悬液为1次计)

分离指标

本试剂盒中的Biotin-Antibody Mix中包含多种抗小鼠的生物素抗体，因此可以结合多种非目标细胞实现CD3+ T细胞的分离纯化。

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，所有组分开封后，有效期为6个月。

试剂盒组成信息

表1. 试剂盒组成信息

分离步骤

实验前准备：Biotin-Antibody Mix、CD3+ T细胞分选磁珠;实验需自备分选Buffer、70μm细胞筛、手术器械、EP管、流式管、离心管若干。

1.取新鲜小鼠脾脏一只，用预冷的PBS冲液清洗组织2-3次。将清洗好的脾脏组织放在 70 μm 细胞筛网上研磨脾脏(推荐使用注射器栓塞)，以预冷的PBS冲液冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于50 mL离心管中，500 g，离心5 min(一只4-6周龄小鼠脾脏可取得5-7×107个脾脏细胞)。

2.离心结束，弃上清，加入5 mL红细胞裂解液，室温裂解5 min，再加入20 mLPBS冲液，500 g，离心5 min。

3.离心完成后，弃上清，将脾脏细胞重悬于3mL PBS冲液中，细胞悬液用70 μm 细胞筛网过滤，再取3-5mL PBS冲液冲洗细胞筛，计数。计数完成后，将脾脏细胞悬液500 g，离心5 min。

4.将细胞重悬于CD3+ T细胞分选Buffer中，调整细胞密度为1×108 cells/mL(分选buffer为含有2 mM EDTA和2% 胎牛血清(FBS)的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5% BSA 的PBS，使用前需预先通过0.22 μm滤膜过滤除菌)。

5.取100 uL细胞悬液加入2 μl Biotin-Antibody Mix混合均匀，4°C 孵育15 min，期间每隔5 min轻弹管壁使细胞与抗体混合均匀。

6.孵育完成后加入1 mL CD3+ T细胞分选Buffer重悬，500 g，离心5 min，弃去上清，加入100 μL的CD3+ T细胞分选Buffer重悬。

7.吸取20 μl CD3+ T细胞分选磁珠(吸取前涡旋振荡重悬磁珠，确保磁珠完全重悬，加入1mL CD3+ T细胞分选Buffer进行重悬清洗磁珠，1000 g离心5 min，弃去上清，加入10 μL的CD3+ T细胞分选Buffer重悬备用)。

8.加入20 μl 清洗过的CD3+ T细胞分选磁珠，混匀后4°C孵育10 min，期间每隔5 min轻弹管壁使细胞和磁珠混合均匀(此试剂盒说明书为分选1×107个脾脏细胞中的CD3+ T细胞的使用说明，如果分选更多的细胞，则可按比例增加Biotin-Antibody Mix、CD3+ T细胞分选磁珠的用量，少于1×107个细胞则将细胞悬液体积补至100 μl，加入2 μl Biotin-Antibody Mix和10 μl CD3+ T细胞分选磁珠)。

9.孵育完成后，加入2.5 ml的CD3+ T细胞分选Buffer重悬，用移液器上下混合吹打5次混匀(避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀)，移入一个无菌流式管中。

10. 将含有细胞的流式管置于磁力架上，静置5 min，待磁珠被吸附，细胞悬液变为清澈后将细胞悬液吸入一个无菌离心管中(期间流式管在磁力架中)，此细胞悬液中即包含纯化的小鼠脾脏CD3+ T细胞，500 g，离心5 min，弃去上清，收集细胞，根据实验需求进行下游实验。

注意事项

1.磁珠和抗体混合液使用和保存过程中均应避免冷冻、高速离心等操作。

2.操作过程应在无菌环境下进行，必须保证操作过程中使用的所有容器及所有直接接触细胞液的器具严格无菌。

3.本产品需要与磁力架配套使用，磁力架需另外购买。

4.本产品仅供科研使用。