大鼠椎间盘髓核细胞分离试剂盒

产品描述

髓核是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。髓核细胞的过早衰老与凋亡是导致椎间盘退行性变过程的主要原因之一，主要表现为退变椎间盘内髓核细胞功能降低和数量减少，使得其Ⅱ型胶蛋白聚糖等基质分泌量下降，最终导致椎间盘维持脊柱高度、承受各方应力等生物力学功能丧失。大鼠椎间盘髓核细胞采用酶消化法提取。

适用范围

本试剂盒适用于分离3w-6w的wistar、SD等不同品系的大鼠提取大鼠椎间盘髓核细胞。

规格

本试剂盒规格为5次(提取2只大鼠为1次计)。

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表，所有组分开封后，有效期为6-8周。

试剂盒组成信息

表1. 分离培养试剂盒组成信息

分离步骤

实验前准备：大鼠椎间盘髓核细胞分离试剂盒;实验需自备手术器械(提前高温灭菌)、6孔/6 cm/10 cm培养皿、离心管若干。

以2只4周龄的SD大鼠为例：

1. 大鼠颈椎脱臼处死后，75%酒精浸泡全身10 min，将大鼠腹部朝上固定，用无菌眼科剪沿大鼠腹中线剪开皮肤，再用两把直镊将皮肤向两侧撕开，暴露腹部肌肉层;沿腹中线剪开腹部肌肉和腹膜，用弯镊轻轻将腹腔内脏器(肠、肝、脾等)向一侧拨开，暴露脊柱腹侧(白色硬骨性结构，即为脊柱，髓核位于相邻椎体之间)。用无菌剪子从大鼠胸椎下段至腰椎上段剪断脊柱(无需取全部脊柱，腰椎段椎间盘最丰富，优先取L1-L6节段);用两把弯镊轻轻夹持脊柱两端，将脊柱从体内完整剥离(夹持时避免用力挤压椎体，防止椎间盘破裂，髓核溢出)。

2. 将剥离的脊柱立即放入含有预冷的大鼠椎间盘组织处理缓冲液的6 cm培养皿中浸泡5 min，并转移至超净台内操作，清洗2-3遍将组织中的血液和污渍去除干净。

3. 将清洗干净的脊柱组织转移至含有预冷的大鼠椎间盘组织处理缓冲液的6 cm培养皿中，一把镊尖固定住单个椎体的一端，另一把镊尖轻轻插入相邻两个椎体之间的缝隙，轻轻撬动镊子，将单个椎间盘从椎体之间完整剥离。用两把直镊夹持单个完整椎间盘的两侧纤维环，轻轻向两侧撕开，用镊尖轻轻挑取内部的胶冻状髓核。取出的椎间盘髓核组织呈胶冻状，用大鼠椎间盘组织处理缓冲液清洗2-3遍后，用无菌眼科剪将髓核组织剪碎至1 mm³左右的细小组织块。剪碎后的髓核组织块转移至15 mL无菌离心管中。

4. 用5 mL大鼠椎间盘组织消化液37℃消化30 min，期间每隔10 min用巴氏吸管拿出轻摇离心管2-3次，再用5 mL大鼠椎间盘组织消化终止液终止消化，消化完成后，用100 μm细胞筛过滤至新的15 mL离心管，1000 rpm 离心5 min。

5. 离心结束后，弃上清，用2 mL大鼠椎间盘髓核细胞专用培养基将沉淀重悬并按照3×105/mL细胞密度铺至培养容器内，37℃、5%CO2的条件下培养。接种后48 h首次换液(去除未贴壁死细胞)，后续每2-3天换液1次，待细胞密度长至80%-90%可以进行传代。

注意事项

1. 建议全程分离操作过程在冰上进行，可提高细胞活性。

2. 试剂盒内各组分中含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。