小鼠脾脏naive CD8+T细胞分离试剂盒（阴选）

产品描述

Naive CD8⁺T细胞，即初始CD8+T 细胞，是指未接触过特异性抗原、处于静息状态的CD8+T细胞亚群，它们通常表型为‌CD8+CD62L+CD44-，是适应性免疫应答中细胞毒性免疫反应的核心起始细胞，同时也是连接固有免疫与适应性免疫的重要桥梁之一，具备自我更新能力与高度分化可塑性，在接收特异性抗原刺激及细胞因子调控后，可定向分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和记忆CD8+T细胞。‌

适用范围

本试剂盒适用于分离小鼠脾脏中的naive CD8+ T细胞，以1×10⁷单细胞悬液为1次计。

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表，所有组分开封后，有效期为6个月。

试剂盒组成信息

表2. 试剂盒组成信息(10/20/50t)

分离步骤

1.取新鲜小鼠脾脏一只，在70 μm细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的PBS冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于50 mL离心管中，500 g，离心5 min(一个小鼠脾脏可取得0.8-1.5×10⁸个脾脏细胞)。

2.离心结束，弃上清，加入5 mL红细胞裂解液，室温裂解5 min，再加入20 mL PBS，500 g，离心5 min。

3.离心完成后，弃上清，将脾脏细胞重悬于PBS，细胞悬液用70 μm细胞筛网过滤后，计数。计数完成后，将脾脏细胞悬液500 g，离心5 min。

4.将细胞重悬于分选buffer中，调整细胞密度为1×10⁸cells/mL(分选buffer为含有2 mM EDTA 和2%胎牛血清(FBS)的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5%BSA的PBS，使用前需预先通过0.22 μm滤膜过滤除菌)。

5.取100 μL细胞悬液加入20 μL小鼠脾脏naive CD8+T细胞阴性分选抗体混合均匀，4°C孵育10min，期间每隔3 min 轻弹管壁使细胞与抗体混合均匀。

6.吸取20 μL naive CD8+T细胞分选磁珠(吸取前涡旋振荡重悬磁珠，确保磁珠完全重悬，加入1 mL CD8+ T细胞分选Buffer进行重悬清洗磁珠，磁力架吸附5 min，弃去上清，加入20 μL的naive CD8+T细胞分选 Buffer重悬)。

7.孵育完成的细胞中直接加入20 μL naive CD8+T细胞分选磁珠，混匀后4°C孵育10min(此试剂盒说明书为分选1×10⁷个脾脏细胞中的naive CD8+T细胞的使用说明，如果分选更多的细胞，则可按比例增加小鼠脾脏naive CD8+T细胞阴性分选抗体、naive CD8+T细胞分选磁珠的用量，少于1×10⁷个细胞则将细胞悬液体积补至100 μL，加入20 μL小鼠脾脏naive CD8+T细胞阴性分选抗体和20 μL naive CD8+T细胞分选磁珠)。

9.孵育完成后，加入1 mL的naive CD8+T细胞分选Buffer重悬。

10.将含有细胞的EP管置于磁力架上，静置5 min，待磁珠被吸附，细胞悬液变为清澈后将细胞悬液吸入一个无菌离心管中，此细胞悬液中即包含纯化的小鼠脾脏naive CD8+T细胞，300 g，离心3 min，弃去上清，收集细胞。

分选效果

对使用本试剂盒分选前后的小鼠脾脏中的naive CD8+T细胞进行流式细胞分析检测显示，分选前后的naive CD8+T细胞纯度分别为20.93%和99.01%。

分选前(CD8+ CD44- CD62L+)

分选后(CD8+ CD44- CD62L+)

注意事项

1.磁珠和抗体混合液使用和保存过程中均应避免冷冻、高速离心等操作。

2.操作过程应在无菌环境下进行，必须保证操作过程中使用的所有容器及所有直接接触细胞液的器具严格无菌。

3.本产品需要与磁吸分离器(IMC-M02)配套使用。

4.本产品仅供科研使用。