人脂肪间充质干细胞分离试剂盒

产品描述

脂肪干细胞(ADSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，有效改善亚健康、早衰等疾病。根据不同来源及分化阶段，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞胚胎干细胞具有分化为多种不同组织的能力。成体干细胞因其来源广泛、增殖能力强等特点，现已成为组织工程学研究的首选种子细胞。其中，脂肪干细胞作为组织工程修复的种子细胞，因其具有来源丰富、取材容易、增殖能力强等优点，正受到越来越多的关注。脂肪干细胞形态类似成纤维细胞，具有较强的增殖能力。在一定的诱导条件下，可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、上皮细胞等，具有多向分化潜能。

适用范围

该试剂盒适用于人脂肪间充质干细胞的提取试剂盒。

规格

本试剂盒规格为5次(以10 mL人脂肪干细胞组织专用消化液为1次计)

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表。所有组分开封后，有效期为 6-8 周，建议尽快使用。

配套培养基信息

表1. 分离培养试剂盒组成信息

分离步骤

实验前准备：人脂肪组织处理液、人脂肪组织消化液、人脂肪间充质干细胞无血清专用培养基;实验需自备70 μm滤网、无菌手术器械、培养器皿、离心管若干。

一、人脂肪间充质干细胞提取

1.去除杂质：若脂肪含有肿胀液或残留血液，应先300 g 离心5 min，去除下层肿胀液及残留血液、纤维组织等杂质;若无相关杂质可直接进入下一步;

2.清洗：将人脂肪组织处理液加入到脂肪组织中，混匀后静置待脂肪组织与人脂肪组织处理液分层，去除下层水层，反复清洗若干次，直至水层无血色。300g离心5 min，收取脂肪层，若有较大组织块，可以用灭菌的剪刀剪碎，直至组织呈细腻的“糊状”或“糜状”;

3.消化：按组织体积，加入2-3倍体积的人脂肪组织消化液溶液，混合均匀，置于水浴恒温振荡器中，37℃，100~120 rpm振荡消化30～60 min，直至细胞混合物成乳状浓稠液体，期间可吹打脂肪组织，辅助消化(具体消化时间可根据工艺进行调整);关键判断：当组织块明显变小、变稀，液体变浑浊，呈“奶昔”状时，表明消化充分。避免过度消化。

4.收集细胞：消化完成后，用与脂肪组织消化酶等体积的完全培养基稀释细胞悬液，300 g离心5 min，小心吸去上层油脂，注意不要破坏下方的胶状沉淀。

5.细胞清洗：用完全培养基重悬SVF细胞(沉淀)，然后用70 μm筛网过滤，再次300 g离心5 min，再次用完全培养基重悬SVF，接种入合适的培养瓶中(如10 mL脂肪组织消化得到的SVF细胞可接种一个T25培养瓶，30 mL脂肪组织消化得到的SVF细胞可接种一个T75培养瓶)(可按 (1-2)×10⁵个细胞/cm² 的密度接种);

6.培养：36~48 h后全量更换完全培养基，以后每72 h换液一次，直至细胞生长至汇合度80～90%进行传代，一般原代分离总共需要6～8天时间。一般每10mL清洗后的脂肪可收获4.0～5.0×106个脂肪干细胞。

二、脂肪干细胞传代

1.吸弃原培养液上清。

2.加入2-3 mL PBS润洗细胞，吸弃PBS。

3.加入1-2 mL人脂肪间充质干细胞消化专用酶至培养瓶中，并轻轻晃动培养瓶至消化液浸润所有细胞，放入37℃培养箱消化细胞1 min(最多不超过2 min)。

4.倒置显微镜下观察，待细胞明显变圆有间隙后(全程请不要拍打培养瓶)，再加入3-5mL含10% 血清的培养基(自备)终止消化。

5.用巴氏管轻轻吹打混匀、分散细胞，250 xg，离心3-5min。

6.去掉上清，首次传代表按1∶2-1∶3比例传代培养。

注意事项

1. 全程分离操作过程建议在冰上进行，分离脂肪干细胞时应避免过度消化、过度重悬等操作导致细胞损伤。

2. 脂肪组织在剪碎的过程中不能研磨，以免破坏细胞。

3. 消化时间根据具体情况在20-30分钟范围内进行相应增减，未见明显组织则可停⽌消化。

4. 原代分离部分建议全程使用4℃离心机。

5. 人脂肪组织处理液、人脂肪组织消化液、人脂肪间充质干细胞专用完全培养基中含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。