小鼠小胶质细胞分离试剂盒

产品描述

小鼠小胶质细胞(Mouse Microglia)是中枢神经系统(CNS)的常驻免疫细胞，属于神经胶质细胞的重要亚群，约占中枢神经系统细胞总数的10%-15%，兼具免疫监视、组织修复、突触重塑等关键功能，是神经免疫、神经退行性疾病研究的核心模型细胞。使用本试剂盒提取所得的小鼠小胶质细胞纯度>90%，可直接进行后续实验。

适用范围

该试剂盒适用于C57BL/6J、BALB/c等不同品系的新生0-3天小鼠原代小胶质细胞提取试剂盒。

规格

本试剂盒规格为5次(以3只小鼠为1次计)

运输和存储条件

2-8℃保存与运输，保质期为参考下表。所有组分开封后，有效期为6-8周，建议尽快使用。

配套培养基信息

表1. 分离培养试剂盒组成信息

分离步骤

实验前准备：小鼠小胶质细胞分离试剂盒;实验需自备1 mL注射器、0.22 μm滤头、70 μm细胞筛、40 μm细胞筛、手术器械、24孔板、离心管若干。

一、小鼠小胶质细胞专用消化液配置：

1 取一管小鼠小胶质细胞专用消化酶(冻干粉)，在掌上离心机中离心1 min将冻干粉完全离心至管底。

2 取1 mL小鼠小胶质细胞专用消化稀释液加入冻干粉中，吹打混匀。

3 用1 mL注射器将溶解的消化酶完全吸出，并使用0.22 μm滤头将消化酶过滤至15 mL离心管中。

4 往15 mL离心管中再加入9 mL小鼠小胶质细胞专用消化稀释液，轻柔颠倒混匀数下，获得小鼠小胶质细胞高浓度消化液。

5 取一支新的15 mL离心管，加入2.55 mL小鼠小胶质细胞专用消化稀释液，并取0.45 mL小鼠小胶质细胞高浓度消化液至该15 mL离心管中，即获得小鼠小胶质细胞专用消化液。

二、小鼠小胶质细胞培养器皿包被：

1 在实验之前需对培养器皿进行包被，选择无菌12孔板或24孔板，在孔内对应加入包被液(12孔板每孔加入1 mL，24孔板每孔加入0.5 mL)。

2 放入37℃细胞培养箱内进行孵育0.5 h-2 h(最长不超过6 h)。

3 孵育完毕后回收包被液(包被液可回收使用2-3次)，用无菌PBS润洗2-3次包被过的孔，润洗完毕后加入无菌PBS备用。

三、小鼠小胶质细胞提取：下面以C57BL/6J小鼠为例。

1.3只3天内新生鼠，断头取大脑皮层，用组织处理缓冲液洗涤，直到没有血迹为止。用尖头镊剥离幼鼠头部及脑壳，取出脑子黑色画圈部分，放入中皿，用组织处理缓冲液洗涤1-2次。将一个脑移至一个新的中皿(两三个脑子用一个中皿，防止太久小鼠皮层神经元细胞组织处理缓冲液升温)，在解剖镜下去除脑膜、嗅球(绿色的那部分)、小脑及两个大脑半球中间的连接物。

2.将剥干净的小鼠皮层转移至盛有3 mL小鼠小胶质细胞组织专用消化液的6 cm皿中，用显微弯镊夹碎皮层，37℃消化15 min(期间1-2次取出进行轻柔吹打10下左右)。

3.在6 cm皿中加入1 mL小鼠小胶质细胞组织消化终止液，一并转移至15 mL离心管中。吹打6-8次，静置3 min，小心取上清转移至新50 mL离心管中。

4.预先分装30 mL小鼠小胶质细胞组织解离液至50 mL离心管中，加入3 mL小鼠小胶质细胞组织解离液至步骤3的15 mL离心管中轻柔吹打6-8次，静置3 min，小心取上清转移至步骤3的50 mL离心管中，重复5遍或无组织块为止。

5.所有混合上清液(50 mL离心管里的)进行过滤(先70 μm后40 μm)，均分至两个15 mL离心管中，用小鼠小胶质细胞组织解离液将两个离心管补足15 mL。200 g离心10 min。

6.用分选buffer重悬，调整细胞数量(用100 μL重悬后再稀释计数，每1×107个细胞用100 μL分选buffer重悬)。

7.加入4 μL小鼠小胶质细胞分选抗体(1×10⁷个细胞对应4 μL分选抗体)，4℃孵育15分钟，期间每隔5 min轻弹Ep管。孵育后300 g离心，5 min。

8.用100 μL分选buffer重悬，加入20 μL小胶质细胞分选磁珠(1×10⁷个细胞对应20 μL分选磁珠)，4℃孵育10 min，期间每隔5 min轻弹Ep管。孵育结束后，300 g离心，5 min。

9.将分选柱放入磁场中，加入1 mL分选Buffer润洗柱子，直至液滴不能滴下。

10.孵育完成后，将细胞悬液加入1 mL分选Buffer后，缓慢加入分选柱中，注意不要产生气泡，待分选柱中的液体流尽时再次加入1 mL分选Buffer，重复清洗5次左右，流出的液体即为未结合磁珠的细胞。

11.将分选柱从磁场中移出，置于合适的离心管中，吸取1-2 mL小鼠小胶质细胞专用完全培养基加入分选柱，使用配套的活塞将结合在分选柱上的细胞快速推出，收集推出的细胞即为目标细胞。将得到的小鼠小胶质细胞铺在合适的培养容器中培养。

注意事项

1. 小鼠大脑离体后建议在冰上操作，分离小鼠小胶质细胞时应避免过度消化、过度重悬等操作导致细胞损伤。

2. 小鼠小胶质细胞高浓度消化液和小鼠小胶质细胞专用消化液需要现配现用(剩余的小鼠小胶质细胞高浓度消化液也可保存在-20℃以便后续稀释再使用，但效果会更差!如做正式实验推荐现配现用)

3. 一个T25/6 cm培养皿可接种5×105个细胞。

4. 本产品需要与分选柱(IMC-M04)、磁力架(IMC-M03)、分选支架(IMC-M05)配套使用。

5. 试剂使用前应使用掌上离心机瞬时离心，保证运输时离心管盖上的抗体/磁珠聚集在底部，以免试剂损失。

6. 小鼠小胶质细胞分离试剂盒中所有组分含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。

7. 本产品仅供科研使用。