小鼠肾小管上皮细胞分离试剂盒

产品描述

小鼠肾小管上皮细胞是构成肾脏肾小管管壁的极性上皮细胞，按解剖位置可分为近端小管、髓袢、远端小管上皮细胞三个亚群，是肾脏物质重吸收、离子转运、尿液浓缩及代谢废物排泄的核心功能细胞，也是肾损伤、肾纤维化等肾病研究的常用原代细胞模型。小鼠肾小管上皮细胞分离试剂盒采用两步灌注法+酶消化法联合差异消化法进行分离纯化小鼠肾小管上皮细胞，细胞纯度>90.0%，纯化后可直接进行RT-qPCR、Western blot等基本生物学实验，贴壁后可进行药理、病理、毒理学、免疫染色等实验操作。

适用范围

该试剂盒适用于Balb/c、C57BL/6J等不同品系的小鼠肾小管上皮细胞提取。

规格

本试剂盒规格为5次(以1只小鼠为1次计)

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表。试剂开封后，尽快使用。

配套培养基信息

表1. 分离培养试剂盒组成信息

分离步骤

实验前准备：小鼠肾小管上皮细胞分离试剂盒(小鼠肾组织处理缓冲液、小鼠肾组织灌注液Ⅰ、小鼠肾组织灌注液Ⅱ、小鼠肾小管上皮细胞专用培养基、小鼠肾小管上皮细胞铺板工作液);实验需自备手术器械、6孔/6cm培养皿、离心管若干。小鼠肾组织灌注液Ⅰ、灌注液Ⅱ置于水浴锅中加热至37℃，备用。下面以1只C57BL/6J小鼠为例：

一、小鼠心脏灌注：

1.麻醉小鼠，用酒精喷洒小鼠胸腹部，在胸腹部做切口，切开皮肤暴露小鼠心脏、肾组织。

2.心脏灌注：调整灌注泵流速为30 mL/min，开始灌注前可用小鼠肾组织处理缓冲液清除灌注管道的气泡，清除完气泡后可先暂停灌注泵，向心尖端将针头扎入左心室(注意：不可扎得太深入到心房，否则难以循环至肾)，将装有37℃预热的30 mL小鼠肾组织灌注液Ⅰ的注射器与灌注泵相连接，开始灌注后，当灌注液充满心脏时，立即剪开右心耳作为灌注出口，使小鼠肾组织灌注液Ⅰ随心脏泵血循环，最终从右心耳流出。

3.观察各脏器无明显血色，再换成20 mL小鼠肾组织灌注液Ⅱ继续灌注消化(泵速不用调整)。

二、小鼠肾小管上皮细胞分离纯化：

1.细胞种板前预先用1-2 mL小鼠肾小管上皮细胞铺板工作液铺至6孔板底部包被0.5-2 h(最长不超过6 h)，吸尽铺板工作液，铺板工作液可回收使用1-2次，使用1 × PBS清洗2-3次皿底后吸去PBS。

2.灌注消化结束后，取出双肾，转移至含有适量预冷的小鼠肾组织处理缓冲液的6 cm培养皿中。

3.移除肾囊和髓质，用小鼠肾组织处理缓冲液反复清洗2-3遍后，将两个肾脏组织转移至新的6 cm培养皿中，先加入10 mL小鼠肾组织消化液，再将两个肾脏剪切成小块组织，置于37℃培养箱中消化5 min。

4.消化后，用巴氏吸管轻轻吹打消化液，再用70 μm筛网过滤未消化的肾组织，加入10 mL小鼠肾小管上皮细胞洗液稀释消化液。

5.将含有小鼠肾小管上皮细胞的细胞悬液转移至50 mL离心管A内，4℃，50 g离心5min。收集第一次沉淀(A管内)。

6.可将上清转移至新的50 mL离心管B中，往离心管B加入5 mL小鼠肾小管上皮细胞洗液后，4℃，50 g离心5 min。收集第二次沉淀(B管内)。(离心管B的上清液可以留下参考注意事项中的步骤再次分离细胞)。

7.将第一次沉淀(A管内)用于20 mL小鼠肾小管上皮细胞洗液重悬，4℃，50 g离心5 min。收集第三次沉淀(A管内)。(离心管A的上清液可以留下参考注意事项中的步骤再次分离细胞)。

8.将第二次沉淀(B管)和第三次沉淀(A管)重悬于1-2 mL小鼠肾小管上皮细胞专用培养基(可与小鼠肾小管上皮细胞防污染辅助试剂配制使用)，计数，将细胞铺在预包被的6孔板内。

9.第二天，收集细胞培养上清液，50 g离心5 min。去除上清，用1-2 mL小鼠肾小管上皮细胞专用培养基(可与小鼠肾小管上皮细胞防污染辅助试剂配制使用)重悬后接种于同一个培养板中。

注意事项

1. 建议全程分离操作过程在冰上进行，可提高细胞活性。

2. 若想获得更多的小鼠肾小管上皮细胞，可将分离步骤中的步骤6和步骤7中收集的上清液按以下步骤进行分离纯化：

将离心管A和离心管B的离心获得的上清液混合，4℃，1000 rpm离心5 min，去除上清液铺在预包被的培养板中培养1-2天，去除培养基，用1×PBS润洗1-2遍，再用0.25%胰蛋白酶消化液37℃消化2-3分钟，去除胰酶溶液，再加0.25%胰蛋白酶消化液37℃消化6-10分钟，每2 min轻轻摇晃细胞并镜下观察消化情况，待细胞大部分变圆有脱落迹象，用2-3 mL小鼠肾小管上皮细胞专用培养基终止消化，1000 rpm离心3-5 min，去除上清，将细胞用小鼠肾小管上皮细胞专用培养基重悬，铺在预包被的培养板中进行细胞培养，培养至细胞密度达80%-90%即可传代。

3.刚提取的小鼠肾小管上皮细胞易污染，建议将小鼠肾小管上皮细胞专用培养基与小鼠肾小管上皮细胞防污染辅助试剂100：1配制使用。

4.小鼠肾小管上皮细胞分离试剂盒中各组分含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。