小鼠前体破骨细胞分离试剂盒

产品描述

小鼠前体破骨细胞(又称作小鼠骨髓单核细胞)分离自骨组织和骨髓，是小鼠骨髓造血干细胞的未成熟免疫前体细胞。外周血中的单核细胞迁移到组织后，可进一步分化为巨噬细胞(负责吞噬病原体、衰老细胞)、树突状细胞(负责启动特异性免疫)或破骨细胞(负责骨吸收，维持骨代谢平衡)。小鼠前体破骨细胞原代分离后，形态为圆形或短梭形，胞体较大(直径 10-18 μm)，胞质呈灰蓝色，胞核为不规则肾形或马蹄形;小鼠前体破骨细胞可以在体外培养为贴壁生长，但贴壁不紧密，温和吹打即可脱落，若不加抑制因子，会自发分化为巨噬细胞(形态变为大而扁平、胞质丰富，出现吞噬泡)。

适用范围

该试剂盒适用于Balb/c、C57BL/6等不同品系的4-8周小鼠原代前体破骨细胞提取试剂盒。

规格

本试剂盒规格为5次(提取1只小鼠的前体破骨细胞为1次计)。

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表。所有组分开封后，有效期为 6-8 周，建议尽快使用。

配套培养基信息

表1. 分离培养试剂盒组成信息

分离步骤

实验前准备：分装好的小鼠骨组织处理缓冲液、小鼠前体破骨细胞清洗液、红细胞裂解液、小鼠前体破骨细胞筛选培养基和小鼠前体破骨细胞专用完全培养基;实验需自备含无菌手术器械、1 mL规格的一次性使用无菌注射器、40 μM细胞筛网、培养器皿、离心管若干。

一、前体破骨细胞提取：下面以C57小鼠为例

1. 取小鼠1只，麻醉处死，75%乙醇浸泡消毒10 min。

2. 在鼠的腿的位置剪开外皮和内皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于小鼠骨组织处理缓冲液中，清洗2-3遍。

3. 剔除股骨和胫骨周围的肌肉及结缔组织，用小鼠骨组织处理缓冲液清洗2-3遍。

4. 用无菌剪刀剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔。

5. 用1mL规格的一次性使用无菌注射器吸取分装好的小鼠前体破骨细胞清洗液，夹起股骨或胫骨，将针头稍微插入一端，将骨髓腔内的骨髓冲至新的培养皿里面。

6. 步骤5重复3次，冲洗至骨头发白。

7. 冲洗完毕以后用移液器或巴氏管轻柔吹打，混匀完毕以后过40 μM细胞筛网，收集液体于15 mL离心管中。

8. 过滤完毕后离心：1000 rpm、5 min，弃上清液，加入5 mL红细胞裂解液，室温裂解2-3分钟，裂解完毕后用3-4倍小鼠前体破骨细胞清洗液进行稀释。

9. 1000 rpm、5 min离心，弃去上清液，用小鼠前体破骨细胞清洗液重悬。

10. 1000 rpm、5 min离心，弃去上清液，加入适当小鼠前体破骨细胞筛选培养基接种于T25培养瓶中置于37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h。

11. 收集培养瓶上清离心，弃上清液，再用小鼠前体破骨细胞专用完全培养基重悬后接种于T25培养瓶中，贴壁两天后的细胞即为小鼠前体破骨细胞。注意细胞密度，太密会导致细胞提前分化，整片脱落。

12. 后续如需诱导小鼠前体破骨细胞为小鼠破骨细胞可以搭配的小鼠破骨细胞专用培养基(IMP-M088-1)进行诱导，每两天换液，4-6天后即可诱导出成熟的破骨细胞。诱导后的破骨细胞为终末分化细胞，属于不增殖细胞群，不能增殖和传代，只能进行原代培养且存活时间较短。

二、小鼠前体破骨细胞消化传代：

1.吸弃原培养液上清。

2.加入1-2 mL PBS润洗细胞两遍，吸弃PBS。

3.加入1 mL小鼠前体破骨细胞消化专用酶至培养瓶中，并轻轻晃动培养瓶至消化液浸润所有细胞，放入37℃培养箱消化细胞1 min。

4.倒置显微镜下观察，待细胞明显变圆有间隙后(全程请不要拍打培养瓶)，再加入3-5 mL含10% 血清的培养基终止消化(稀释法终止消化，则培养基用量不应低于3 mL)。

5.用巴氏管轻轻吹打混匀、分散细胞，250 xg，离心3-5min。

6.去掉上清，用小鼠前体破骨/破骨细胞专用培养基重悬培养。

注意事项

1. 全程分离操作过程建议在冰上进行，分离前体破骨细胞时应避免过度消化、过度重悬等操作导致细胞损伤。

2. 与股骨和胫骨相黏连的肌肉组织、软骨组织等应尽量去除，避免影响分离出来的前体破骨细胞纯度。

3. 冲洗骨髓腔过程中应保持全程在冰上操作，可一定程度维持前体破骨细胞的活性。

4. 原代分离部分建议全程使用4℃离心机。

5. 小鼠前体破骨细胞专用完全培养基中含有关键成分，请

6. 本试剂盒所有组分含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。