小鼠结肠类器官完全培养基

产品描述

小鼠结肠类器官培养基套装(Mouse Colonic Organoid Medium Set)是一款用于扩增和分化小鼠结肠类器官的完全培养基。扩增时的小鼠结肠类器官主要由结肠干细胞和结肠祖细胞组成，分化后的小鼠结肠类器官由结肠吸收细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成。结肠类器官在自我更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面，重现了体内结肠上皮的特征，因此是小鼠结肠研究的理想体外模型。

产品信息

表1. 培养基组成信息

小鼠结肠类器官完全培养基使用说明

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期一年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。

小鼠结肠类器官的建立与传代培养

原代小鼠结肠类器官的建立

准备适量标准型基质胶于冰上解冻

1.取样：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌条件下取出近胃端3~10 cm结肠组织，用镊子去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含双抗的类器官专用基础培养基中。

注意：如新鲜标本无法立即处理，组织标本应浸泡在类器官组织保存液中，冰上运输尽快处理。

2.清洗：使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片或载玻片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于类器官专用基础培养基中清洗，重复清洗 2 次。 将清洗后的结肠组织剪碎至 2 mm 宽，转移至新的类器官专用基础培养基中，清洗多次，直至上清液澄清。

注意：原代分离过程中清洗所用的类器官专用基础培养基应加入1%双抗，从而减少后续污染的可能。

3.消化：加入10 mL 小鼠肠道消化液，置37℃摇床上，80 rpm，消化 30 min左右，可用移液器轻柔吹打肠段，取上清显微镜下观察，待上清出现完整隐窝即可终止消化，若无隐窝可适当延长消化时间。

4.离心：消化完成后，300g，离心5min，弃去消化液。

5.重悬：加入类器官专用基础培养基，用 10 mL 移液管轻轻吹打、重悬组织碎片，吹打后的组织悬液进行 70 μm 滤网过滤。

6.收集：收集穿过滤网的组织悬液，300 g ，4℃，离心 3 min。

7.计数：弃上清，使用类器官专用基础培养基重悬组织沉淀，取 20 μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300 g 离心力 4℃离心 3 min，弃上清后置于冰上。

8. 用适量的基质胶 重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每 10 μL基质胶悬液包含 70 至 100 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

9.将基质胶和组织细胞的混合悬液点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠结肠类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。

12.将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

13.每 2~3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠结肠类器官应在5至7天内建成。

小鼠结肠类器官的传代培养

1. 用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将结肠类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。

2. 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。

3. 300×g，4℃离心 3 min，弃上清，用经过润洗液润洗的枪头加入1 mL 类器官传代消化液并充分混匀，37℃条件下消化 3～10 min，每3 min取少量悬液镜检观察类器官状态。

4. 消化结束后加入 1 mL 上皮类器官基础培养基吹打混匀，300×g，4℃离心 3 min，弃上清，再次加入 1 mL类器官专用基础培养基重悬。

5. 300×g，4℃再次离心 3min，弃上清后置于冰上。

6. 用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔30 μL 左右。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

8. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 30 min 左右待基质胶凝固后取出。

9. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的小鼠结肠类器官完全培养基，24孔板每孔 500 μL。

10. 将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，直到类器官需要进一步的实验。