国际细胞系身份认证委员会(简称ICLAC)

ICLAC国际细胞系身份认证委员会

全称：国际细胞系身份认证委员会(The International Cell Line Authentication Committee，简称ICLAC)

官网：https://iclac.org/

ICLAC简介

国际细胞系认证委员会 (International Cell Line Authentication Committee, ICLAC)成立于2012年。它的成立是为了帮助学术界发现更多的错误识别/被污染的细胞进而避免在研究实验中使用;同时进一步提高科学家们的细胞鉴定意识以及推动细胞株鉴定成为科研实验中的常态化工作。目前，ICLAC的合作组织或机构有ATCC SDO、CCTCC、ECACC、JCRB等，它发布的相关指南与建议相当具有权威性。

为什么细胞要进行鉴定

以下为ICLAC细胞鉴定方面的指南与建议：

在开展细胞株相关的研究项目之前：

1)根据可靠的信息来源选择所要使用的细胞株

根据细胞的基因型、表型以及起源等公开信息(包括组织或细胞类型、相关疾病、供体性别和年龄、供体祖籍背景)来选择最适合进行实验研究的细胞株。Cellosaurus是查询细胞株遗传信息的很好的资源库：https://www.cellosaurus.org/

2)查询细胞株是否是已知的错误识别/被污染的细胞

由于交叉污染、标签标记错误或其他原因，错误识别/被污染的细胞不再与其最初来源的遗传信息保持一致。交叉污染最初只会导致细胞培养物混合，但是生长更快的污染细胞会逐渐取代原来的、真正的细胞株。ICLAC建立的Register of Misidentified Cell Lines可以帮助查询：https://iclac.org/databases/cross-contaminations/

3)从可靠、规范的来源/单位获取细胞株

细胞株应该从原始来源获取：要么是权威的细胞库，要么是细胞最初建系的实验室或机构。从二次来源获取的细胞株，如实验室间交换的细胞，有很大的风险是错误识别/被污染的细胞。应当每次要求供应方提供细胞株已做过鉴定的证据，并检查供应方是否有信誉。

何时鉴定细胞是否为错误识别/被污染的细胞

4)实验开展之前和论文投稿之前应进行细胞鉴定

当细胞株建系时、细胞株进入新实验室时、准备新的细胞库时，都必须进行细胞鉴定。如果将其用于实验工作，细胞应当在实验开展之前和实验结束之后(即文章投稿之前)进行鉴定。细胞株在长时间培养之后、发生任何遗传修饰及选择后以及表型发生变化时也应当及时进行鉴定。

5)使用基于基因型分析的方法进行细胞鉴定

由于细胞行为和表达模式会随着细胞传代和培养条件的变化而变化，因此基于表型分析的方法并不适合进行细胞鉴定。进行细胞鉴定的基因型分析方法可以区分不同来源的细胞株。基于基因型分析的合适的细胞鉴定方法包括：

a)STR(Short tandem repeat)分型。这是人源细胞鉴定的金标准、共识方法，包括在实验室间的结果比较时使用的最小STR基因座集合。STR分型这种方法也逐渐应用到了小鼠细胞的鉴定。

b)SNP(Single nucleotide polymorphism)分型。这种方法并非是基于SNP的细胞鉴定的标准方法。但是，如果细胞通过STR分型被证明正确的，则这种方法可以用于内部测试(例如，作为高通量测序分析的一部分)。已经证明，几组SNP位点能够有效的对人源细胞进行鉴定。

6)将细胞鉴定结果与数据库比对、以确定是否为错误识别/被污染的细胞

检测错误识别/被污染的细胞取决于实验室间结果的比较，这种比较需要包含很多不同细胞株(包括最有可能引起交叉污染的生长迅速的肿瘤细胞)STR数据的专业细胞数据库。合适的细胞数据库就包括Cellosaurus的STR Similarity Search Tool (CLASTR)：https://www.cellosaurus.org/str-search/

7)使用基于基因型的方法对细胞株进行物种鉴定

如果某种细胞来源于STR分型或SNP分型不适用的物种，那么应该进行对细胞进行物种鉴定。DNA条形码技术是进行细胞物种鉴定的标准化、共识的方法，这种方法基于对线粒体基因细胞色素c氧化酶亚基1(通常称为CO1, COI1或COX1)进行测序。物种特异性多重PCR分析也可以快速确认细胞的物种来源。另外，细胞遗传学分析同样可以用来进行物种鉴定。

8)检测微生物污染

所有细胞株应当进行常见微生物污染的检测，如支原体。还可能进行病毒污染检测，这具体取决于细胞株类型和研究实验。

能够看出，ICLAC关于细胞株鉴定的指南与建议十分详尽。我们可以提取一些关键的信息作为参考：

1.在选择细胞株之前，应当去ExPASy数据库或ICLAC进行检索，查看细胞株的相关遗传信息、查看是否为已知的错误识别或被污染的细胞。

2.要从可靠权威的单位购买细胞株，并要求供应方提供相应的细胞株身份证明(即便附带供应方的鉴定报告，细胞进入实验室时仍需再次进行鉴定);尽量避免从二次来源的渠道(如实验室间的交换细胞)获取细胞株。

3.细胞株不仅要在实验开始前、论文投稿前进行鉴定;当细胞长时间传代培养后、发生任何遗传修饰及选择后以及表型发生变化时也应当及时进行鉴定。

4.使用基于基因型分析的方法进行细胞鉴定。相较SNP分型，更为推荐的是，作为金标准方法的STR分型。目前，STR分型也逐步应用到小鼠细胞鉴定的工作中，相较于其他鼠类细胞，目前针对小鼠细胞鉴定的STR分型技术已经相对成熟。

5.进行STR鉴定的同时，须对细胞株进行支原体检测。

合理的库存维持流程

科学家Mamie Yu给出了一种细胞系库存维持建议的流程。每个步骤都需要质量控制，以避免人为错误和污染。

在收到一个细胞系(原瓶)后，要对其进行扩增，最好是在一个单独的超净台中，专门用于处理新的细胞系。将细胞系的信息储存在数据库中，做好记录备份。对细胞进行支原体和跨物种PCR分析的检测，并使用STR和SNP指纹图谱以确认细胞身份。

初始扩增后的细胞被存储为“主储备”，以保持细胞系的低传代来源。然后对这些细胞进行再次扩增，检测支原体，并作为“工作储备”储存起来。取其中一个样本复苏扩增，以确定细胞的活力(解冻质量控制)。在使用这些工作储备前，仍需进行支原体、跨物种污染检测和SNP基因分型以控制质量。在“工作储备”超过“主储备”的(最多)20倍之后，则需要弃用旧的“工作储备”，从“主储备”扩增产生新的“工作储备”。

同时，在任何阶段的质量控制失败都需要重新检测，因为可能会出现假阳性或样品混淆的情况。在初始扩增后，所有后续的重新扩增或常规质量控制，都要使用SNP平台进行监测。将细胞系注释与数据库中的STR/SNP图谱联系起来，为将任何基于细胞的数据与原生细胞系联系起来提供了基础，从而有利于数据整合和比较。

防止细胞交叉污染的建议

尽管ICLAC提出的细胞株鉴定指南和建议十分详尽，但仍可提取一些关键信息：

1. 开始实验前：需要在权威数据库(如ICLAC)进行检索，以查看细胞株相关遗传信息、了解是否为已知的错误识别或污染。

2. 获取细胞株：需要从可靠权威的单位购买，并要求供应方提供相应的细胞株身份证明，尽量避免从二手渠道(如实验室间的交换)获取细胞株。

3. 细胞株鉴定：在获取细胞株保藏前、实验开始前、论文投稿前、长时间传代后、发生遗传修饰/表型变化后均应当及时进行鉴定。

4. 细胞培养准备工作：根据已了解的细胞特性，提前准备好合适的培养基和血清等，沿用此前的培养条件进行扩增。

5. 避免交叉感染：

(1) 避免同时处理生长快和生长慢的细胞

(2) 在接触细胞后，不要将移液管放回培养基或试剂瓶

(3) 避免气溶胶在敞开的培养物间传递

(4) 避免使用未塞棉花的移液管

(5) 避免在冻存、复苏和培养时错误标记

(6) 必要时进行细胞株鉴定和微生物(支原体、细菌、真菌等)污染检测

(7) 定时观察培养物状态、保证检测的真实有效

(8) 尽量避免共用培养基和(或)移液管

6. 细胞鉴定方法：可使用STR或SNP分型。

参考文献

1. http://www.jsdna.org/cell

2. http://www.jsdna.org/mobile/information/xuz

3. Bairoch A. The Cellosaurus, a knowledge resource of the cell line. J Biomol Tech 2018 29(2): 25-38. doi: 10.7171/jbt.18-2902-002.

4. Capes-Davis A et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. Int J Cancer 2010; 127(1):1-8. doi: 10.1002/ijc.25242.

5. Korch CT et al. Human Cell Line Authentication: Standardization of Short Tandem Repeat (STR) Profiling, ASN-0002-2022. ATCC Standards Development Organization ASN-0002-2022. Manassas, VA, USA.

6. Almeida J. L & Korch C.T. Authentication of Human and Mouse Cell Lines by Short Tandem Repeat (STR) DNA Genotype Analysis. In: Markossian S, Grossman A, Brimacombe K, et al., editors. Assay Guidance Manual (2023).

7. Almeida JL et al. Interlaboratory study to validate a STR profiling method for intraspecies identification of mouse cell lines. PLoS One 2019; 14(6):e0218412. doi: 10.1371/journal.pone.0218412.