小鼠肝类器官完全培养基

产品描述

小鼠肝类器官完全培养基是一款用于构建、维持培养及传代扩增小鼠肝组织来源类器官的完全培养基。该产品可以从小鼠肝组织快速生成肝祖细胞类器官，极大程度维持了来源于体内肝组织的特征，优化了实验步骤，提高类器官构建效率。

产品信息

表1. 培养基组成信息

小鼠肝类器官完全培养基使用说明

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期一年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有抗生素。

小鼠肝类器官的建立与传代培养

原代小鼠肝类器官的建立

实验前准备

将小鼠肝实质灌注液Ⅰ、灌注液Ⅱ置于水浴锅中加热至37℃，备用。实验需自备注射器、静脉留置针、手术器械、70 μm过滤筛、离心管若干。

一、肝脏灌注

1.麻醉并且固定小鼠，酒精喷洒清洗腹部。剪开小鼠腹腔，沿肝脏上方剪开胸腔隔膜，使上腔静脉暴露，用止血钳夹住上腔静脉。

2.拨开小鼠肠组织，暴露小鼠下腔静脉和肝门静脉，在下腔静脉的位置插入静脉留置针并固定好位置，轻轻拔出针芯，拔出时针管处有回血，此时外套软管留在血管内，进行灌注。

3.将装有肝实质灌注液 Ⅰ的注射器与静脉留置针相连接，轻轻推动注射器，灌注液 Ⅰ 缓慢灌入，可见肝脏充盈，此时剪开门静脉引流，保持灌流速度在5 mL/min至排尽肝脏内血液、肝组织呈现蜡黄色为止。

4.换上肝细胞灌注液 Ⅱ，低速(3 mL/min)灌流，并节律性挤压门静脉切口(挤压5-10 s左右，间隔30 s-1 min,让肝脏充盈，提高消化率)，持续消化5-15 min不等，消化肝脏直至用棉签按压肝脏有塌陷感或者部分透明感，条纹样的裂纹。

5.将肝脏沿着膈肌周围整个剪下来，转移到一个装有类器官专用基础培养基的培养皿中。在超净台中用镊子去除胆囊和肝脏外的包膜，轻轻抖动组织使肝实质细胞如流沙状流出，未完全分散的部分用镊子轻轻拨散至类器官专用基础培养基中。

二、肝实质分离纯化

6.用类器官专用基础培养基润洗70 μm筛网，将上述步骤中的培养皿内的细胞浊液移至筛网上方过滤。

7.4℃、50 xg离心5分钟。

8.小心弃去上清(低速离心后，肝实质细胞以松散的方式沉在底部，弃上清时切勿吸力过大或者直接倾倒上清)，加入15 mL类器官专用基础培养基重悬沉淀。

9.重复步骤2，小心弃去上清，加入5 ml类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀。

10.检测细胞活率，依据细胞活率和数量配置30%-50%的活细胞纯化液(纯化液浓度越高，得到的肝实质细胞活性越好，但与此同时，得到的细胞数量会减少，需要依据实验进行取舍，如配置30% 细胞纯化液配方为：细胞纯化液：PBS = 3:7)。将细胞悬液小心添加至两倍体积的细胞纯化液面上，细胞悬液与细胞纯化液间应产生明显分层。

11.400 x g、4 ℃离心10分钟(使用水平转子，加速度减速度均为最低)。

离心完毕后离心管底部的沉淀即为纯化后的肝实质细胞。

三、铺胶

12. 用适量类器官专用基础培养基悬细胞沉淀(建议铺胶时细胞密度在每30ul体系2000-5000个细胞，太稀或太密都会影响构建成功率)，置于冰上预冷，加入适量基质胶(IMV-A017)混匀配置成70%胶浓度的细胞-培养基-基质胶混合液，点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

13.凝胶：将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

14.加入培养基：待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠肝类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。在原代培养前四天应额外在培养基中添加y27632(IMC-014-Y)提高类器官存活率，终浓度为10 uM。

15.后续培养：将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。 每 3~4 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠肝类器官应在20天左右进行传代。

类器官的传代培养

1. 去胶：用经过类器官抗粘附液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。

注意：移取类器官前枪头都应用类器官抗粘附液润洗，以减少类器官损失。后续不再特意注明。

2. 消化： 300 g 离心 3 min，弃上清，加入10倍体积的类器官传代消化液并充分混匀，37℃条件下消化孵育3～10 min至类器官分散。消化结束后加入适量类器官专用基础培养基中止消化。300 g 离心 3 min。

3. 清洗： 弃上清，加入 1 mL 类器官专用基础培养基重悬。300 g 离心 3 min。

4. 铺胶： 用适量类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀(推荐加入10倍沉淀体积)，置于冰上预冷，加入适量基质胶(IMV-A017)混匀配置成70%胶浓度的细胞-培养基-基质胶混合液，点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

6.凝胶：将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

7.加入培养基：待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠肝类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。

8. 将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，每 3~4 天更换培养基，直到类器官需要进一步的实验。