小鼠肾类器官完全培养基

产品描述

小鼠肾类器官完全培养基是一款用于构建、维持培养及传代扩增小鼠肾组织来源类器官的完全培养基。该产品可以从小鼠肾组织快速生成肾类器官，极大程度维持了来源于体内肾组织的特征，优化了实验步骤，提高类器官构建效率。

产品信息

表1. 培养基组成信息

小鼠肾类器官完全培养基使用说明

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期一年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。

小鼠肾类器官的建立与传代培养

原代小鼠肾类器官的建立

1.取样：将分离的小鼠肾转移到10 cm培养皿中，培养皿置于冰盒上，加入10 mL 4℃预冷的含双抗(IMC-601)的类器官专用基础培养基，将组织表面的血管、筋膜和脂肪轻取舍弃。

注意：如新鲜标本无法立即处理，组织标本应浸泡在类器官组织保存液中，冰上运输尽快处理。

2. 清洗：将标本使用含双抗(IMC-601)的类器官专用基础培养基进行清洗，反复涮洗约5 - 10次，涮洗至清洗液澄清，去除清洗液。

3. 机械分离：将组织剪碎成5mm2大小组织块。

4. 消化：加入约10倍样本体积的完全组织消化液(一般加入10 mL)，置37℃摇床上，80 rpm，消化 30 min。 每隔10 min取出吹打，将消化组织团块分散。

5. 终止过筛：消化完成后，加入5%血清终止，将消化液过70 μm细胞筛网去除组织块，并用类器官专用基础培养基冲洗。400g 离心5 min收集细胞沉淀。

6.裂红：弃上清，加入1 mL红细胞裂解液重悬，冰上静置3 min。300 g 离心3 min。观察细胞沉淀颜色，若沉淀颜色仍是红色，重复本步骤。

7.过筛：将细胞沉淀用1 mL类器官专用基础培养基重悬。过70 μm细胞筛网去除较大的粘连细胞团，用类器官专用基础培养冲洗，300 g 离心3 min。

8.铺胶： 用适量类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀(推荐加入10倍沉淀体积)，置于冰上预冷，加入适量基质胶(IMV-A017)混匀配置成70%胶浓度的细胞-培养基-基质胶混合液，点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

9.凝胶：将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

10.加入培养基：待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠肾类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。在原代培养前四天可额外在培养基中添加y27632(IMC-014-Y)提高类器官存活率，终浓度为10 uM。

11.后续培养：将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。每 3~4 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠肾类器官应在3至4天内建成。

类器官的传代培养

1. 去胶：用经过类器官抗粘附液(IMV-A003)润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。

注意：移取类器官前枪头都应用类器官抗粘附液(IMV-A003)润洗，以减少类器官损失。后续不再特意注明。

2. 消化： 300 g 离心 3 min，弃上清，加入10倍体积的类器官传代消化液并充分混匀，37℃条件下消化孵育3～10 min至类器官分散。消化结束后加入适量类器官专用基础培养基中止消化。300 g 离心 3 min。

3. 清洗： 弃上清，加入 1 mL 类器官专用基础培养基重悬。300 g 离心 3 min。

4. 铺胶： 用适量类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀(推荐加入10倍沉淀体积)，置于冰上预冷，加入适量基质胶(IMV-A017)混匀配置成70%胶浓度的细胞-培养基-基质胶混合液，点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

5.凝胶：将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

6.加入培养基：待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠肾类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。

7. 将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，每 3~4 天更换培养基，直到类器官需要进一步的实验。