小鼠肝胆管(扩增)类器官原代分离培养套装

产品描述

小鼠肝胆管(扩增)类器官原代分离培养套装是一种化学定义的细胞培养基，用于建立和培养从成体干细胞衍生的小鼠肝胆管类器官。肝胆管的自我更新上皮细胞是由位于肝脏的干细胞及其祖细胞的扩增所驱动的。肝胆管类器官因其上皮在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面的表现，而具有真实器官的特征。肝胆管类器官可以在分化培养基中诱导出肝样细胞，为小鼠类肝脏发育和疾病的研究提供了前所未有的模型。

产品信息

表1. 试剂盒

表2. 其他自备材料和试剂

小鼠肝胆管类器官完全培养基的制备

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期一年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。

正常组织消化液使用说明

1. 收到正常组织消化液后，置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10 ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的消化液解冻后即可使用。

注意：配制后的正常组织消化液可在 2-8℃ 储存，建议 24 h 内使用，或-20℃ 储存3个月。

类器官专用基础培养基使用说明

1. 可用于类器官原代建立时组织的清洗和消化后组织的重悬(建议加入1%双抗);

2. 可用于类器官复苏时的清洗，以去除残余冻存液;

3. 用于类器官传代、冻存时类器官的清洗;

4. 可以自行添加生长因子等成分配置成类器官完全培养基。

注意：

l 类器官专用基础培养基可在4℃冰箱中稳定保存，建议分装后使用;

l 本产品不含任何抗生素，如果需要请额外添加

小鼠肝胆管类器官的建立与传代培养

原代小鼠肝胆管类器官的建立

准备适量标准型基质胶于冰上解冻

1.用 50 或15ml 离心管在预冷的类器官组织保存液中收集原代小鼠肝组织。将组织样品保持在4°C，直到开始分离。

2.用手术剪刀或手术镊子去除非肝脏成分，如果没有可直接进行下一步。在接下来的步骤中，使用前在移液管头的内表面涂上抗粘附冲洗液，以避免样品粘附在移液管壁上。

3. 用类器官专用基础培养基冲洗肝组织2-3次。

注意：原代分离过程中清洗所用的类器官专用基础培养基应加入1%双抗，从而减少后续污染的可能。

4. 在细胞培养皿中，用外科剪刀或手术刀将组织切成5 mm3的小碎片。解剖的样品必须足够小，能够通过10 ml移液管的尖端。

5. 转移组织样本到50 ml离心管中，加入10 ml左右预冷的类器官专用基础培养基。

6. 用 10 ml 移液器轻轻上下吹打后，静置1-2min，直到组织沉降在底部后，弃去上清，重复3次左右(若组织碎片过小无法自然沉降，吹打后可300g，离心3 min)。

7加入10ml正常组织消化液，在 37℃下以100转/分的转速消化肝组织。消化时间不应超过30分钟。为防止消化过度，应在显微镜下检查消化过程中是否出现胆管结构。

9. 当消化液中离散的胆管数量较多时，添加2%FBS停止消化，4°C，300g离心3分钟。

10.弃去上清，加入类器官专用基础培养基，用10ml移液管用力上下吹打5-10次后，静置1-2min待组织碎片自然沉降后，吸取上清通过70 um滤网过滤。

11. 加入10mL类器官专用基础培养基，再次重复步骤10。

12. 将两管细胞悬液在 4°C 下，300g离心3分钟。抽吸并丢弃上清。

13. 用 10mL类器官专用基础培养基重新悬浮细胞沉淀，在4°C下，300g离心3分钟。

14. 弃去上清，加入2～3 mL红细胞裂解液冰上裂解3～5 min，裂解后加入PBS终止裂解，4°C，300g离心3分钟。。

15. 弃去上清液，用基质胶和类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。大约每25 μL的基质胶含有20-100个胆管结构。切勿过多稀释基质胶 (基质胶浓度应大于70%)，以确保形成固体胶滴。

16. 在 24 孔细胞培养板的底部，取30-50 μL细胞基质胶悬液滴在孔中心，不要让基质胶接触孔壁。基质胶可能会在离心管或移液器尖端凝固，请尽快进行接种。

17. 将培养板放入37°C和5%CO2的培养箱中15-30分钟，使基质胶凝固。

18. 准备所需量的小鼠肝胆管类器官扩增培养基。基质胶液滴凝固后(15- 30min)，小心地沿孔壁加入500 μL/孔完全培养基。不要直接将培养基添加到基质胶液滴的顶部，因为这可能会破坏液滴。

19. 将培养板置于37°C和5% CO2的培养箱中。

20. 每 3-4 天更换一次培养基，小心地从孔中抽吸培养基，并用新鲜的、预热的小鼠肝胆管类器官培养基代替。密切监测类器官的形成。理想情况下，小鼠肝胆管类器官第一次传代应在5至8天之间。

小鼠肝胆管类器官的传代培养

1. 用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的离心管中。

2. 用经过润洗液润洗的枪头用力吹打重悬类器官悬浮液，多次吹打(5~10 次)使类器官与基质胶分离吹，300 g 离心 3 min。

3. 弃上清，加入 1-2mL 类器官传代消化液重悬类器官沉淀，37℃二氧化碳培养箱消化3～10 min，每3 min取少量悬液镜检观察类器官状态。当类器官已分散成碎片时即可机械吹打分散类器官后直接 300g 离心 3 min，离心后弃上清。

注意：离心后若有较多的基质胶残留，可在弃去上清后加入类器官回收液重悬，4°C 或冰上放置30 min左右，每10 min混匀一次，30 分钟后300g 离心 3 min，即可去除大部分基质胶。

4. 加入类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀，清洗1-2 次。

5.用适量的基质胶重悬清洗后的类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

6. 将基质胶和类器官的混合悬液点在 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30 -50 μL 左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

7. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15-30 min 左右待基质胶凝固后取出。

8. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入500 μL/孔提前预热的小鼠肝胆管类器官扩增培养基。

9. 将细胞培养板放入37℃培养箱中进行培养，每天于显微镜下观察类器官的生长状态，每3天只有于显微镜下拍照并记录多个视野中的类器官的形态。

类器官的冻存

1. 将消化完成后的细胞悬液，200 g ，离心5 min，弃去上清。

2. 用基础培养基清洗两次后，加入 4℃预冷的类器官冻存液，轻轻吹打混匀后迅速转移至细胞冻存管中(冻存管内细胞悬液体积应大于0.5 mL)。

注: 每1 mL 冻存液推荐冻存1×106个细胞或对应细胞量的类器官。

3. 将冻存管放入细胞冻存程序降温盒内(降温盒须提前平衡至室温)，随后立即将降温盒放入-80℃超低温冰箱中;也可将冻存管进行人工梯度降温处理，如 4℃ 静置 10 min，-20℃保存1小时，-80℃保存过夜。

4. 次日或 12 小时后将冻存管于-80℃超低温冰箱转移至液氮中长期保存。

类器官的复苏

1. 提前在 37℃条件下预热类器官专用基础培养基。

2. 在 37℃的水浴中快速解冻细胞冻存管，当冻存管内冻存物仅剩些许冰渣残留时立即停止水浴并及时转移至洁净操作台。

3. 将细胞悬液转移至离心管中，缓缓加入5-10倍体积的类器官专用基础培养基，轻轻混匀。

4. 200 g，离心3-5 min，弃上清，再次加入类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀。

5. 再次加入类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀，重复步骤4。

6. 弃上清后所获细胞沉淀可用于后续类器官培养。