小鼠肝类器官原代分离培养套装

产品描述

小鼠肝类器官原代分离培养套装是一款用于构建、维持培养及传代扩增小鼠肝组织来源类器官的完全培养基。该产品可以从小鼠肝组织快速生成肝祖细胞类器官，极大程度维持了来源于体内肝组织的特征，优化了实验步骤，提高类器官构建效率。

产品信息

表1. 试剂盒组成信息

表2. 其他自备材料和试剂

小鼠肝类器官完全培养基使用说明

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期一年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有抗生素。

小鼠肝类器官的建立与传代培养

原代小鼠肝类器官的建立

实验前准备

将小鼠肝实质灌注液Ⅰ、灌注液Ⅱ置于水浴锅中加热至37℃，备用。实验需自备注射器、静脉留置针、手术器械、70 μm过滤筛、离心管若干。

一、肝脏灌注

1.麻醉并且固定小鼠，酒精喷洒清洗腹部。剪开小鼠腹腔，沿肝脏上方剪开胸腔隔膜，使上腔静脉暴露，用止血钳夹住上腔静脉。

2.拨开小鼠肠组织，暴露小鼠下腔静脉和肝门静脉，在下腔静脉的位置插入静脉留置针并固定好位置，轻轻拔出针芯，拔出时针管处有回血，此时外套软管留在血管内，进行灌注。

3.将装有肝实质灌注液 Ⅰ的注射器与静脉留置针相连接，轻轻推动注射器，灌注液 Ⅰ 缓慢灌入，可见肝脏充盈，此时剪开门静脉引流，保持灌流速度在5 mL/min至排尽肝脏内血液、肝组织呈现蜡黄色为止。

4.换上肝细胞灌注液 Ⅱ，低速(3 mL/min)灌流，并节律性挤压门静脉切口(挤压5-10 s左右，间隔30 s-1 min,让肝脏充盈，提高消化率)，持续消化5-15 min不等，消化肝脏直至用棉签按压肝脏有塌陷感或者部分透明感，条纹样的裂纹。

5.将肝脏沿着膈肌周围整个剪下来，转移到一个装有类器官专用基础培养基的培养皿中。在超净台中用镊子去除胆囊和肝脏外的包膜，轻轻抖动组织使肝实质细胞如流沙状流出，未完全分散的部分用镊子轻轻拨散至类器官专用基础培养基中。

二、肝实质分离纯化

6.用类器官专用基础培养基润洗70 μm筛网，将上述步骤中的培养皿内的细胞浊液移至筛网上方过滤。

7.4℃、50 xg离心5分钟。

8.小心弃去上清(低速离心后，肝实质细胞以松散的方式沉在底部，弃上清时切勿吸力过大或者直接倾倒上清)，加入15 mL类器官专用基础培养基重悬沉淀。

9.重复步骤2，小心弃去上清，加入5 ml类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀。

10.检测细胞活率，依据细胞活率和数量配置30%-50%的活细胞纯化液(纯化液浓度越高，得到的肝实质细胞活性越好，但与此同时，得到的细胞数量会减少，需要依据实验进行取舍，如配置30% 细胞纯化液配方为：细胞纯化液：PBS = 3:7)。将细胞悬液小心添加至两倍体积的细胞纯化液面上，细胞悬液与细胞纯化液间应产生明显分层。

11.400 x g、4 ℃离心10分钟(使用水平转子，加速度减速度均为最低)。

离心完毕后离心管底部的沉淀即为纯化后的肝实质细胞。

三、铺胶

12. 用适量类器官专用基础培养基悬细胞沉淀(建议铺胶时细胞密度在每30ul体系2000-5000个细胞，太稀或太密都会影响构建成功率)，置于冰上预冷，加入适量基质胶(IMV-A017)混匀配置成70%胶浓度的细胞-培养基-基质胶混合液，点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

13.凝胶：将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

14.加入培养基：待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠肝类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。在原代培养前四天应额外在培养基中添加y27632(IMC-014-Y)提高类器官存活率，终浓度为10 uM。

15.后续培养：将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。 每 3~4 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠肝类器官应在20天左右进行传代。

类器官的传代培养

1. 去胶：用经过类器官抗粘附液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。

注意：移取类器官前枪头都应用类器官抗粘附液润洗，以减少类器官损失。后续不再特意注明。

2. 消化： 300 g 离心 3 min，弃上清，加入10倍体积的类器官传代消化液并充分混匀，37℃条件下消化孵育3～10 min至类器官分散。消化结束后加入适量类器官专用基础培养基中止消化。300 g 离心 3 min。

3. 清洗： 弃上清，加入 1 mL 类器官专用基础培养基重悬。300 g 离心 3 min。

4. 铺胶： 用适量类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀(推荐加入10倍沉淀体积)，置于冰上预冷，加入适量基质胶(IMV-A017)混匀配置成70%胶浓度的细胞-培养基-基质胶混合液，点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。

6.凝胶：将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

7.加入培养基：待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠肝类器官完全培养基，24孔板每孔500 μL，避免破坏已凝固结构。

8. 将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，每 3~4 天更换培养基，直到类器官需要进一步的实验。

类器官的冻存

1. 将消化完成后的细胞悬液，200 g 离心5 min，弃去上清。

2. 用类器官专用基础培养基清洗两次后，加入类器官冻存液，轻轻吹打混匀后迅速转移至细胞冻存管中(冻存管内细胞悬液体积应大于0.5 mL)。

注意： 每1 mL 冻存液推荐冻存1×106个细胞或对应细胞量的类器官。

3. 将冻存管放入细胞冻存程序降温盒内(降温盒须提前平衡至室温)，随后立即将降温盒放入-80℃超低温冰箱中;也可将冻存管进行人工梯度降温处理，如 4℃ 静置 10 min，-20℃保存1小时，-80℃保存过夜。

4. 次日或 12 小时后将冻存管于-80℃超低温冰箱转移至液氮中长期保存。

类器官的复苏

1. 提前在 37℃条件下预热类器官专用基础培养基。

2. 在 37℃的水浴中快速解冻细胞冻存管，当冻存管内冻存物仅剩些许冰渣残留时立即停止水浴并及时转移至洁净操作台。

3. 将细胞悬液转移至离心管中，缓缓加入5-10倍体积的类器官专用基础培养基，轻轻混匀。

4. 200 g，离心3-5 min，弃上清，再次加入类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀。

5. 再次加入类器官专用基础培养基重悬细胞沉淀，重复步骤4。

6. 弃上清后所获细胞沉淀可用于后续类器官培养。