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ATCC细胞培养
人外周血淋巴细胞分离液可将人血液组织样本温和、快速地消化解离为细胞悬液,得到的单细胞悬浮液可用于各种下游应用,如可用于流式细胞术、qPCR/RNA-seq检测等实验。
该试剂盒适用于人血液样本的消化处理。
15℃-37℃避光保存,严禁冷藏冷冻保存;使用时保持无菌操作规范,并在18℃-22℃环境温度下进行操作,20℃条件下分离效果最佳。
常温保存,有效期 2 年。本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启封后置常温保存。如 4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。
表1. 分离培养试剂盒组成信息
产品名称 | 产品规格 | 储存条件 |
人外周血淋巴细胞分离液 | 200 mL | 20°C 24个月 |
1.实验前准备:
适用仪器:最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。
2.PBMC 最佳分离时间
血液离体后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件,请务必于 4 小时内进行分血步骤,超过4小时很难顺利进行分离。
血液离体时间 | 分离效果 |
2 小时内 | 最佳 |
2-4 小时 | 可接受 |
4-6 小时 | 细胞活性下降,分离效果不佳 |
6 小时以上 | 分离效果极差,直至分离不出细胞 |
3.分离液的使用环境
分离液需常温(37℃-15℃)避光保存,严禁冷藏冷冻保存;使用时严格遵守无菌操作规范(超净工作台或生物安全柜内),并在 18℃-22℃环境温度下进行操作,20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围,有可能使分离液密度发生 改变,造成分离效果不佳。
4.参考值(目的细胞参考范围)
本试剂可保证目的细胞的提取率大于 80%,不是纯度。如需获得高纯度目的细胞,请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量,减少成本。
1.分装人外周血淋巴细胞分离液;分选buffer作为清洗液,实验需自备巴氏管若干、离心管若干。
2. (a)取一支15 mL无菌离心管,先加入适量分离液(建议体积≥3 mL)。随后,将稀释后的血液样本或新鲜抗凝血沿管壁缓慢加至分离液上层,注意保持两液面分层清晰。推荐配比为5 mL分离液对应4 mL稀释血液;若样本量较少,需确保分离液体积不低于3 mL,抗凝血用量控制在0.2~3 mL范围内。常温下,500g,离心25min。
(b)如果是50ml 离心管(包括高效离心管):最佳比例:20ml 分离液+ 20ml 稀释过的血液;最佳离心条件:20℃环境下,650g 离心 30min。
3.离心后,离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色(人)淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
4.小心吸取血浆层转移到新离心管中;小心吸取离心管中的环状乳白色(人)淋巴细胞层转移到新离心管中。
5.向含有(人)淋巴细胞的离心管中,加入10ml分选buffer(可自行配置),混匀细胞。250g,离心10min。弃去上清。
6.用吸管吸取5ml分选buffer(可自行配置)重悬所得的细胞。
7. 250g,离心10min。弃去上清。
8.重复清晰两次,弃去上清,用0.5ml分选buffer或根据下一步实验要求加入相对应的液体,重悬所得细胞。
情况一:淋巴细胞层混杂红细胞,吸取有红细胞混杂的淋巴细胞层。
取 15 毫升离心管加入红细胞混杂的淋巴细胞层,根据红细胞残余数量酌情加入 5-8 倍红细胞裂解液。
如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液(产品编号:IMV-A008需另购)将红细胞裂解(具体方法见“红细胞裂解液使用说明”)即得目的细胞。
参考红细胞裂解液说明书操作。少时多次裂解后获得淋巴细胞。
本实验淋巴细胞提取率大于 80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例,用户可适当进行参考。
红细胞 | 白细胞 | 血小板 | |||
含量(个/L)( | (4.0-5.5)×1012 | (4.0-10.0)×109 | (1.0-3.0)×1011 | ||
中性粒细胞 | 淋巴细胞 | 单核细胞 | |||
50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示:
出现情况 | 出现原因 | 建议解决方案 |
离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层 | 转速过小或离心时间过短 | 适当增减转速 |
离心后目的细胞存在于分离液中 | 转速过大或离心时间过长 | |
离心后白环层弥散 | 细胞密度过大 | 调整细胞密度 |
离心后白环层太浅或看不见 | 细胞密度过小 |
2.吸取过多的淋巴细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。
3.不当的稀释方法会降低细胞得率及活性。稀释液要求:不含钙镁离子的缓冲液或培养基。血液样本经过稀释则分离过程中需适当降低离心力和离心时间。
4.试剂盒内的产品请在超净工作台内打开,按照所需要量分装,并且用封口膜封住瓶口,即取即用,以避免污染。
5.常温保存,有效期2年。若4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。
6. 关于血液分离液效果讨论。
(a)脐带血:脐带血收集到细胞分离时长一般大于2小时,冷藏存放与运输在所难免。与外周血静脉采血相比,大多脐带血分离效果较差,为此,厦门优化配方以提高脐带血PBMC 分离得率,欢迎广大医疗及科研用户致电咨询。
(b)案例:应用过免疫动员剂类药物,普通的样本密度分离液分离效果较差,有大量的粒细胞混杂,不能使用。为客户定制一款专用的样本密度分离液,PBMC的提取率大大提高,纯度提高了50%以上,得到客户的认可,欢迎广大医疗及科研用户致电咨询。
产品规格:1*10^6
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产品规格:1*10^6
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