小鼠肝实质灌注液I

产品说明

使用说明

分离步骤

实验前准备：将小鼠肝实质灌注液Ⅰ、灌注液Ⅱ置于水浴锅中加热至 37℃,备用。实验需自备

注射器、静脉留置针、手术器械、75 μm 过滤筛、离心管若干。

一、肝脏灌注

1.麻醉并且固定小鼠，酒精喷洒清洗腹部。

2.剪开小鼠腹腔，沿肝脏上方剪开胸腔隔膜，使上腔静脉暴露，用止血钳夹住上腔静脉。

3.拨开小鼠肠组织，暴露小鼠下腔静脉和肝门静脉，在下腔静脉的位置插入静脉留置针并固定好

位置，轻轻拔出针芯，拔出时针管处有回血，此时外套软管留在血管内，进行灌注。

4.将装有肝实质灌注液Ⅰ的注射器与静脉留置针相连接，轻轻推动注射器，灌注液 Ⅰ 缓慢灌入，

可见肝脏充盈，此时剪开门静脉引流，保持灌流速度在 5 mL/min 至排尽肝脏内血液、肝组织呈现蜡黄

色为止。

5.换上肝细胞灌注液 Ⅱ,低速(3 mL/min)灌流，并节律性挤压门静脉切口(挤压 5-10s 左右，

间隔 30s-1min,让肝脏充盈，提高消化率)，持续消化 5-15min 不等，消化肝脏直至用棉签按压肝脏有

塌陷感或者部分透明感，条纹样的裂纹。

6.将肝脏沿着膈肌周围整个剪下来，转移到一个装有细胞洗液的培养皿中。在超净台中用镊子去

除胆囊和肝脏外的包膜，轻轻抖动组织使肝实质细胞如流沙状流出，未完全分散的部分用镊子轻轻拨

散至细胞洗液中。

二、肝实质分离纯化

1.用细胞洗液润洗 75 μm 筛网，将上述步骤中的培养皿内的细胞浊液用宽头吸头或者巴氏管移

至筛网上方过滤。

2.4℃、50 xg 离心 5 分钟。

3.小心弃去上清(低速离心后，肝实质细胞以松散的方式沉在底部，弃上清时切勿吸力过大或者直

接倾倒上清)，加入 15 mL 细胞洗液，用宽头吸头或者巴氏管轻轻重悬沉淀。

4.重复步骤 2，小心弃去上清，加入 5 ml 细胞洗液重悬细胞沉淀。

5.依据细胞活率和数量配置 30%-50%的活细胞纯化液(纯化液浓度越高，得到的肝实质细胞活性

越好，但与此同时，得到的细胞数量会减少，需要依据实验进行取舍，如配置 30% 细胞纯化液配方为：细胞纯化液：分离纯化稀释液 = 3:7)。将细胞悬液小心添加至两倍体积的细胞纯化液面上，细胞悬液

与细胞纯化液间应产生明显分层。

6.400 xg、4 ℃离心 10 分钟(使用水平转子，加速度减速度均为最低)。

离心完毕后离心管底部的沉淀即为纯化后的肝实质细胞，用贴壁培养基重悬。

三、肝实质分离纯化

1.肝实质细胞种板前预先用 Ⅰ 型鼠尾胶原蛋白(以下简称鼠尾胶)铺至培养器皿底部包被 0.5-2 h

(最长不超过 6 h)，吸尽鼠尾胶，鼠尾胶可回收使用 1-2 次。

2.使用 1 × PBS 清洗皿底后吸去 PBS。

3.将细胞悬液按照 3 x 105/ml 细胞密度铺至鼠尾胶包被的培养器皿中，转移至细胞培养箱中。

4.4 h 后显微镜下观察，肝实质细胞呈较大圆形、有明显双核结构，将培养器皿内的贴壁培养基更换为维持培养基。

注意事项

1. 使用本产品时应尽量注意无菌操作，避免污染;

2.不宜长时间放置于室温或4度长期保存;

3.2-8℃中解冻，摇匀后使用，切忌反复冻融，建议分装冻存;

4.由于不同的组织或者细胞对消化液的作用反应不一样，因此操作人员应根据实际情况，确定最佳消化时间;消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁和生长状况。