人外周血中性粒细胞分离液

产品描述

人外周血中性粒细胞分离液可将人血液组织样本温和、快速地消化解离为细胞悬液，得到的人外周血中性粒单细胞悬浮液可用于各种下游应用，如可用于流式细胞qPCR/RNA-seq检测等实验。

产品信息

表1. 产品组成信息

适用范围

该分离液适用于分离人外周血样本来源的中性粒细胞。

运输和存储条件

常温保存，有效期1年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

操作步骤

1.实验前准备：

适用仪器：最大离心力可达1200g的水平转子离心机。

2.中性粒细胞最佳分离时间

血液离体后2小时内。如达不到2小时内分血条件，请务必于4小时内进行分血步骤，超过4小时很难顺利进行分离。

3.分离液使用环境

分离液需室温(10℃-30℃)避光保存，严禁冷藏冷冻保存;使用时严格遵守无菌操作规范(超净工作台或生物安全柜内)，并在18℃-22℃环境温度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生改变，造成分离效果不佳。

4.实验步骤

①分装人外周血中性粒细胞分离液、分选buffer作为清洗液，实验需自备巴氏管若干、离心管若干。

②取一支15 mL无菌离心管，先将全血等体积用分选buffer进行稀释，即5 mL全血等体积加入5 mL的分选buffer，往离心管加入5 mL的中性粒细胞分离液(即分选buffer：全血：中性粒细胞分离液=1：1：1)。随后，将稀释后的血液样本或新鲜抗凝血沿管壁缓慢加至分离液上层，注意保持两液面分层清晰。推荐配比为5 mL分离液对应10 mL稀释血液。常温下，使用水平转子离心机650 g，离心25 min，升1降0。

③ 离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层细胞为淋巴细胞层，下层细胞为中性粒细胞层。淋巴细胞分离明显在最上层，中性粒有部分红细胞，可裂红去除。(注：女性样本的中心粒细胞数量要比男性少，部分女性样本可能存在分离失败的风险，具体原因尚不知)

图 1(左图为男性样本，右图为女性样本)

④.小心吸取白色层转移到新离心管中;小心吸取离心管中的环状乳白色(人)中性粒细胞层转移到新离心管中。

⑤向含有人外周血中心粒细胞的离心管中，加入足量的分选buffer(15 mL的离心管的需要灌满)，混匀细胞。300g，离心10 min。弃去上清。

⑥用吸管吸取5 mL分选buffer重悬所得的细胞。(若需要裂红，可在此步骤将分选buffer替换成3 mL红细胞裂解液进行操作，裂红结束后需要加入10 mL的分选buffer进行终止，后继续离心)

⑦300 g，离心10 min。弃去上清。

⑧重复清洗两次，弃去上清，用0.5 mL分选buffer或根据下一步实验要求加入相对应的培养基，重悬所得细胞进行下一步的实验。

分离效果

对使用本产品分离纯化前后的人外周血中的中心粒细胞进行CD16+和CD66b+流式细胞分析检测显示，分选后的人外周血中心粒细胞纯度为97.40%。

染色鉴定

对使用本产品分离纯化前后的人外周血中的中心粒细胞进行染色鉴定，分选后的中心粒细胞经迪夫染色呈阳性，阳性率大于95%。

注意事项

(1) 本产品可常温运输，常温保存，有效期12个月。

(2) 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃(夏季20℃，冬季22-25℃)的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最好在取血2h内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离效果越差。血液放置超过6 h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。