人子宫内膜异位病灶来源的永生化基质细胞系的建立

今天推荐的是由厦门市妇科疾病研究与诊断重点实验室暨厦门大学第一附属医院妇产科和厦门大学生命科学学院在2020年发表于Reproductive Biology and Endocrinology(2020IF：3.235，JCRQ1)的一篇文章，通讯作者是Qiong-Hua Chenand和Qing-Xi Chen教授，人肝细胞癌3D器官型培养模型。

文章摘要

背景：子宫内膜异位症是一种良性的妇科疾病，具有明显的雌激素依赖性，无炎症反应。原发性子宫内膜异位症间质细胞在子宫内膜异位症研究中的应用受限于激素和细胞因子反应性的短寿命分化。本研究的目的是建立和表征永生化人子宫内膜异位基质细胞(ihESCs)。

方法：子宫内膜异位症样本取自卵巢子宫内膜异位症患者，从子宫内膜异位症组织中分离原代子宫内膜异位基质细胞。原代细胞用慢病毒感染建立端粒酶逆转录酶(hTERT)诱导的永生化细胞，定量检测mRNA和蛋白质的表达。采用实时聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western Blot，CCK-8测定和EdU标记测定来评估ihESCs的生长情况。进行核型测定以检测ihESCs的染色体。克隆形成测定和裸鼠致瘤性测定用于评估结肠形成和肿瘤发生能力。

结果：ihESCs通过慢病毒感染持续过表达hTERT，寿命显着延长至31代。ihESCs的形态、增殖和核型保持不变。上皮间质转化(EMT)标志物、雌激素代谢蛋白和雌/孕激素的表达受体(ERs和PRs)未发生改变。此外，雌激素的治疗增加了 ihESCs 的增殖和 EMT。 脂多糖(LPS)和IL-1β显著诱导炎症反应。 ihESCs的克隆形成能力与原代细胞一致，远低于Ishikawa细胞。 此外，裸鼠致瘤性测定表明，ihESCs 不能触发肿瘤形成。

结论：本研究建立并表征了永生化子宫内膜异位症间质细胞系，其寿命更长，细胞形态和生理功能保持原代细胞，永生化细胞对雌激素和炎症反应保持正常反馈。此外，永生化细胞不具有致瘤能力。因此，ihESCs 可用作体外细胞工具来研究子宫内膜异位症的发病机制。

研究背景

子宫内膜异位症是育龄女性常见的妇科疾病，定义为子宫内膜存在于子宫位置之外. 估计有10% 的育龄妇女可能患有子宫内膜异位症. 子宫内膜异位症的出现一般伴有慢性盆腔痛经痛严重性交困难，甚至不孕。据估计，47%的不孕妇女有子宫内膜异位症。而且，子宫内膜异位症的高复发率需要3次或以上的手术。因此，子宫内膜异位症对大量女性患者产生负面影响，并间接影响医疗保健系统和社会。

尽管报道的许多因素与子宫内膜异位症的发生密切相关，但该病的病因尚不清楚。关于子宫内膜异位症发生的致病学说，月经逆行假说是最公认的版本，其中子宫内膜组织的逆行性月经通过通畅脱落。输卵管进入腹膜腔，然后在异位部位粘附侵袭和增殖。这些过程与家族遗传激素反应的背景和免疫因素有关。

子宫内膜异位症被认为是雌激素和炎症依赖性疾病。据报道，在位子宫内膜组织中芳香酶水平的增加允许异位组织植入腹膜表面， Capellino 等人都声称雌激素通过其功能性受体调节巨噬细胞调节免疫反应。发现 ER 通过增加 IL-1β来抑制 TNF-α 诱导的细胞凋亡并促进炎症，从而增强细胞粘附和异位子宫内膜异位组织的增殖。 因此，在子宫内膜异位病变的建立过程中，雌激素和炎症的刺激是相互有益的。

为了研究子宫内膜异位症的分子机制，培养的人原代子宫内膜异位细胞是理想的体外工具。然而，原代子宫内膜异位细胞的适用性在很大程度上受到细胞培养过程中去分化的限制，包括激素和细胞因子反应性的丧失，以及寿命短。本研究的目的是建立和表征hTERT诱导的永生化子宫内膜异位造口细胞系(ihESCs)，该细胞系保持原始形态和增殖、EMT标志物、雌激素合成酶和雌激素/孕激素受体在ihESCs 保持不变。此外，ihESCs含有正常数量的染色体，并且通过致瘤性测定证实没有恶性转化。

研究内容

1.慢病毒感染建立hTERT诱导的永生化子宫内膜异位基质细胞

使用慢病毒来增加原发性子宫内膜异位基质细胞的 hTERT 表达。如图1a所示，红色荧光蛋白(RFP)作为分子示踪剂，在15和25代的ihESCs中稳定表达。进一步的研究被用来检测来自不同代系的 ihESCs 中 hTERT 的表达。在图 1b 和 c 中，与原代细胞相比，ihESCs 中 hTERT 的 mRNA 和蛋白质均显着增加。此外，光学显微镜(上图1d)和扫描电镜(下图1d)观察到ihESCs和原代基质细胞之间没有明显的细胞形态变化。为了记录ihESCs和原代细胞的寿命，连续细胞培养的结果表明，达到 31 代的 ihESC 的寿命比原代细胞的 14 代长得多(图 le)。

图1. 通过慢病毒转染 hTERT 建立永生化人子宫内膜异位造口细胞 (ihESCs)。 a 观察受感染细胞的红色荧光以估计感染效率。 b hTERT mRNA在第5、15和25代ihESC中的表达。 通过 Western Blot 检测到来自不同传代的 ihESCs 的 c hTERT 蛋白水平。 d 使用光学显微镜(上)和扫描电子显微镜(下)观察到的 ihESC 的形态。 e 原代细胞和 ihESC 的寿命。 数据代表平均值±SEM。 **P < .001, ***P < .0001。

2. ihESCs的细胞生理与原代细胞相比保持不变

为进一步探讨ihESCs的细胞生理是否发生增殖变化，并检测了不同的标记蛋白。如图 2a 所示，ihESCs 的增殖活性非常类似于原代细胞。 ihESCs中上皮间质转化(EMT)标志物的表达与原代细胞一致(图2b)。此外，包括COX-2、HSD17B1和CYP17A1在内的雌激素代谢蛋白与原代细胞保持相似。 ERs和PRs的表达也处于原始水平(图2c)。此外，ihESCs维持Vimentin的高表达和Cytokeratin 18的低表达，这表明ihESCs的间充质细胞特征是顽强的(图2d)。进一步检查ihESC的染色体，进行核型分析。如图2eihESCs 呈现正常数量的23 对染色体。

图.2. 与原代基质细胞相比，ihESCs 的表型和标记蛋白保持不变。 a 通过 CCK-8 测定法检测到的 ihESC 和原代基质细胞的生长曲线。 b 来自原代造口细胞和 ihESCs 的上皮-间质转化的蛋白质表达。 c 原代细胞和 ihESC 中雌激素代谢蛋白和雌激素/孕激素受体蛋白的水平。 d 通过免疫细胞化学 (ICC) 评估上皮和间充质细胞的鉴定。 e ihESCs的染色体核型分析和分选结果(右)

3. 正常的雌激素反应保持在 ihSC 中

为了证明 ihESCs 对雌激素刺激的反应，使用 200nM 雌激素治疗 ihESCs。如图 3a 所示，雌激素治疗显着促进了 ihESCs 的增殖。雌激素对 ihESCs 的刺激增加了 EdU 标记的细胞数量，这表明雌激素可以增强 ihESCs 的细胞分裂(图 3b 和 c)。此外，雌激素降低了 Cytokeratin 18 和 E-cadherin 蛋白的表达，但增强了间充质标记蛋白的水平(图3d)。Thusestrogen促进ihESCs的增殖和EMT，这表明ihESCs对雌激素保持正常反应。

图3. 在 ihESCs 中发现了正常的雌激素反应和炎症。 a 在雌激素刺激下 ihESCs 的增殖。 b EdU 标记的测定用于监测用雌激素处理的 ihESC 的细胞分裂。 c EdU 检测的定量分析。 d 雌激素处理后来自 ihESCs 的 EMT 标志物的蛋白质表达。 刺激 LPS 的 ihESCs 中炎症因子的 mRNA (e) 和蛋白质 (f) 表达。 来自用 IL-1β 处理的 ihESCs 的炎症因子的 mRNA (g) 和蛋白质 (h)。 数据代表平均值±SEM。 *P < .05，**P < .001，***P < .0001

4. 在 ihESC 中检测到炎症反应

为了验证ihESCs的炎症反应，分别使用100ng/ml LPS和10ng/ml IL-1β来诱导炎症。如图 3e 和 f 的结果，LPS 显着促进了 IL-1IL-6、IL-10 和 MCP-1 的表达。这些炎症因子的 mRNA 和蛋白质随着 IL-1B 的处理而显着增加(图 3g 和h)。 因此，ihESCs 中保留了正常的炎症反应。

图 4. ihESC 不会恶性转化以触发肿瘤。 用于评估 ihESCs 致癌潜力的集落形成试验。 b 进行裸鼠致瘤性测定以评估 ihESC 的致瘤能力

5. ihESCs 不具备致瘤能力

为了确定ihESCs是否为恶性转化，进行了集落形成试验和裸鼠致瘤性试验。如图4a所示，ihESCs的克隆形成能力与原代细胞一样弱，远低于子宫内膜癌Ishikawa细胞。此外，与诱导肿瘤形成的Ishikawa细胞不同，ihESCs和原代间质细胞均不能引发肿瘤的发生(图.4b)。因此，ihESCs 保留了原代细胞的特征并且没有恶性转化。

结论与讨论

本研究通过过表达hTERT建立了永生化人子宫内膜异位基质细胞(ihESCs)，永生化细胞的寿命超过30代，比原代细胞长得多。ihESCs的形态和增殖保持不变。EMT标志物的表达，雌激素代谢ihESCs 中的蛋白质和雌激素/孕激素受体与原代细胞相比没有变化。 ihESCs的染色体部分核型保持正常。在ihESCs中观察到雌激素和炎症反应的正常反馈。此外， ihESCs没有恶性转化引发肿瘤的形成。因此，我们建立了具有稳定特性和功能的永生化子宫内膜异位基质细胞，这可能是一种实用的细胞工具。

根据关于子宫内膜异位症高通量测序的大量报道，发现了数千个在子宫内膜异位症中异常表达的基因与正常和在位子宫内膜相比，子宫内膜异位症病变显着突变，包括炎症反应的变化激素失调、增殖和凋亡紊乱、促进血管生成和EMT。因此，子宫内膜异位症细胞在子宫内膜异位症的机制研究中更受模型细胞的重视，建立具有稳定特性和长寿命的模型细胞是可观的因此建立永生化子宫内膜异体细胞是为研究提供细胞工具的有效途径。本研究建立的永生化细胞ihESCs保持形态增殖和EMT标记不变，表明永生化过程不影响细胞的生长和类型。另一方面，众所周知，与正常和在位子宫内膜相比，子宫内膜异位病灶中的雌激素显着增加，并且雌激素合酶的显着增加与子宫内膜异位症的复发密切相关28-30Ou结果表明，这些雌激素合酶包括COX-2、HSD17B1和CYP17A1保持不变。与原代细胞一致。此外，雌/孕激素受体的表达没有改变，说明雌、孕激素的功能途径保持完整，而且永生化细胞的染色体数目保持正常，表明基因不受永生化的影响。因此，这些结果表明， ihESCs 保留了作为主要子宫内膜基质细胞的形态和基因特征。

子宫内膜异位症被认为是雌激素依赖性和炎症性疾病[2930]。雌激素主要通过其核受体刺激子宫内膜异位细胞的增殖[31]。而我们之前的研究发现雌激素显着促进EMT[32]。本研究中雌激素刺激明显促进了ihESCs的增殖和EMT，这表明了原始能力对原代细胞雌激素的反应仍然存在于ihESCs中。另外LPS和IL-1B的处理可以引发ihESCs的明显炎症，这表明ihESCs中存在炎症反应。因此，ihESCs足以用于研究雌激素和炎症的作用和机制。子宫内膜异位症。

先前的一项研究分析了与雌激素/孕酮生物合成和信号细胞周期调节以及不同永生化人子宫内膜异位症上皮细胞和基质细胞产生的细胞因子相关的众多基因表达。通过逆转录病毒转染 hTERT 建立了永生化子宫内膜异位症上皮细胞和基质细胞，从而保持雌激素和孕激素受体的表型和表达的主要特征。然而，这些永生化细胞中细胞形态生理学和恶性转化的变化缺乏识别。为了全面评价我们的永生化细胞，对细胞形态增殖EMT标志物和不同的细胞生理进行监测，未发生变化。此外，核型分析和成瘤实验表明，ihESCs没有恶性转化，是可靠的模型细胞。总之，本研究建立了永生化的子宫内膜异位症基质细胞，并表明这些细胞具有更长的寿命、主要的生理特征并且没有恶性转化。因此，胚胎干细胞可能用作证明子宫内膜异位症的实验模型。