原代细胞传代培养过程及注意事项

原代细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是种将细胞种保存下去的方法。同时也利培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。那么原代细胞如何进行传代培养及在过程中应注意哪些事项?

原代细胞传代培养的过程

1、组织块培养物的传代过程基本操作过程

1) 将原代培养物连同底物盖玻片一同取出，置于无菌的培养皿上。

2) 用刀将培养物分割，刮去多余的部分，剩余继续培养的部分。一般是分割刮去组织块外围的部分组织，留下中央的部分组织继续培养。或部分分割并挑去组织块，留下迁移出来的细胞于底物盖玻片上继续培养。也可以将组织块挑出，再种植于新的底物盖玻片上继续培养。

3) 给剩余的培养物加上培养液，放入培养箱中继续培养。

2、分离细胞培养物—贴壁型细胞的传代过程：有两项核心工作：一是分割培养物，二是再接种

基本操作过程

1) 取出培养瓶，打开瓶盖，用吸管吸出旧的培养液。

2) 用无 Ca2+ 、Mg 2+ 的平衡盐溶液轻轻漂洗培养物1 次到 2 次，洗去残余血清后弃去平衡盐溶液。

3) 在培养皿内加入胰蛋白酶溶液， 室温下消化 5min 到 15min 显微镜下观察细胞突起缩回近似圆形、细胞之间的间隙增大时停止消化。

4) 吸管吸去消化液后立即加入含血清培养液或蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶的活性，使消化终止。

5) 用弯头吸管吸取培养皿内的培养液反复吹打瓶皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶皿底壁。

6) 低速离心，弃去上清液。

7) 用新鲜培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度。

8) 根据传代目的将细胞悬浮液接种到一个或多个新的培养器皿中。

3、分离细胞培养物—悬浮型细胞的传代过程

基本操作过程

1) 将培养物移入离心管低速离心。根据传代目的将细胞悬液接种在一个或多个新的培养皿中。

2) 用吸管吸去上清液，加入新鲜培养液使细胞沉淀重新悬浮

3) 根据传代目的将细胞悬液接种在一个或多个新的培养皿中。

4) 加足培养液，加盖封口，加入恒温箱中继续培养。

原代细胞传代培养的注意事项

1)离体培养的细胞生命力比较脆弱，因此传代时细胞没有生长到培养瓶底壁面积的 80%以前，不要急于传代。

2)首次传代，由于原代培养中各种类型的细胞常混杂生长，传代时不同细胞又不同的消化时间，因而要根据需要注意及时处理。

3)对贴壁细胞消化后的吹打过程要有序进行，要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的四角处， 确保瓶皿底壁各处的细胞都被吹打脱离。 吹打时动作不宜过猛， 吹出液体的力度要适中，否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。

4)对于贴壁能力较弱，容易脱壁的细胞，可以不经蛋白酶原消化处理和终止消化这两步，直接对原代培养物或经漂洗后用吸管进行吹打使细胞脱离瓶皿底壁。 这种直接吹大的方法对生命力旺盛的细胞如某些肿瘤细胞较为合适。 高强度机械吹打易对细胞造成伤害较大， 细胞也常有较大数量的丢失， 因而绝大部分贴壁生长的细胞需消化后才能吹打， 一般不单独采用高强度机械吹打。

5)首次传代时适当增大接种的细胞密度，使培养的细胞间尽快发生相互作用，有利于传代细胞的存活。

6)传代数是指对培养物传代的次数，它不等于细胞分裂的次数或细胞的代数，而仅代表传代操作的次数。

7)传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并进行原代培养的程度。只是因为传代后的细胞生长并不像刚开始原代培养时那样缓慢罢了。

8)每经过一次传代，细胞的生长环境就相应发生一次较大变化。体外生长的细胞若处于动荡的生活环境中， 细胞的遗传特性往往容易发生改变。 经过多次传代培养的细胞， 往往容易转化为恶性细胞。 因此， 传代对细胞生长和性状会产生不利影响， 一般情况下要尽可能减少传代次数。

无菌操作注意事项

1)操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2)点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3)操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4)不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5)瓶子开口后要尽量保持45"C斜位。

6)吸溶液的吸管等不能混用。