Annexin V-EGFP/PI凋亡细胞检测试剂盒

产品描述

细胞凋亡生物体内的一种基本的生物学现象，在机体去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用，在细胞培养过程中，由于培养条件、操作方式的不合适以及人为诱导等原因会引起细胞发生凋亡; Annexin V是一种35 - 36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与分布在细胞膜脂质双层的内侧磷酯酰丝氨酸具有高度亲和力，在细胞发生凋亡时，细胞膜外翻，磷酯酰丝氨酸得以与Annexin V结合，因此Annexin V可作为为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一，碘化丙啶(PI)是一种无法穿过细胞膜的有机物，在细胞膜受损时，可进入受损的细胞与细胞内的DNA结合并释放红色荧光，本试剂盒通过利用荧光的Annexin V和PI染料可有效的检测出凋亡的细胞。

适用范围

本试剂盒适用于检测人、鼠等生物凋亡的细胞。

运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表，所有组分开封后，有效期为6个月。

试剂盒组成信息

表1. 试剂盒组成信息

染色步骤

1.取培养过程中或人为诱导的发生了凋亡的细胞一株，计数，取2-5×105个细胞，将细胞悬液在离心机中以300 g，离心5 min，去除上清(贴壁细胞可通过吹打或使用不含EDTA的胰酶消化的方式使细胞脱落，将细胞悬液在离心机中以300 g，离心5 min，去除上清)，加入200 μl的1×Binding Buffer重悬细胞。

2.在离心机中以300 g，离心5 min，去除上清。

3.将细胞以90 μl的1×Binding Buffer重悬，加入5 μl Annexin V-EGFP和5 μl PI 染色液，轻轻吹匀;避光、室温(20 ~ 25°C)孵育15 min。

4.在离心机中以300 g，离心5 min，去除上清。

5.加入100 μl 1 × Binding Buffer，轻轻混匀，染色后样品可在1 h内用流式细胞仪或荧光显微镜下检测。

样品分析

1.流式分析：Annexin V EGFP可在FL1通道检测;PI的红色荧光可在FL2或FL3通道检测，用FlowJo等软件进行数据分析，FL1为横坐标，FL2或FL3为纵坐标，根据Annexin V和PI荧光值确定两荧光参数阴阳界限，划定十字门。典型的实验中细胞可分为三个亚群：活细胞为双阴性(Annexin V EGFP-/PI-);早期凋亡细胞为Annexin V-EGFP单阳性(Annexin V EGFP+/PI-);晚期凋亡细胞为Annexin V-EGFP和PI双阳性(Annexin V EGFP +/PI+)。

2.荧光显微镜分析：滴一滴染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片或细胞爬片盖上细胞，荧光显微镜下察。在荧光显微镜下Annexin-EGFP呈绿色荧光，PI呈红色荧光(对于贴壁细胞，也可使用细胞爬片培养细胞并诱导细胞凋亡并使用本试剂盒染色)。

检测效果

使用10 μM的药物Brotezomib诱导悬浮细胞THP-1细胞5 h和贴壁细胞T24细胞24h后使用本试剂盒的检测效果：

注意事项

1. Annexin V EGFP和PI荧光染料都存在淬灭的问题，染色后应尽快检测荧光强度，且整个实验过 程尽量避光下进行。

2.若使用胰酶处理贴壁细胞，应尽可能地去除胰酶，防止 Annexin V-EGFP 降解从而导致染色失败。

3. Annexin V EGFP与细胞的结合需要在含有Ca2+的Binding Buffer中。

4. Annexin V-EGFP 和碘化丙啶(PI)均具有一定毒性，操作时务必小心。

5. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。