CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8）

产品简介

Cell Counting Kit-8，简称CCK-8(或CCK8)试剂盒，是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测试剂盒。其检测原理在于，在电子耦合试剂存在的情况下，检测试剂中的WST-8化合物被活细胞内脱氢酶还原成具有水溶性的橙黄色甲臜化合物,该物质在450 nm处有最大吸收峰。甲臜量与活细胞数成正比，即细胞增殖越多越快，则颜色越深;细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解;而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可 以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳 定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。WST-8和WST-1相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。

本试剂盒中WST-8对细胞无明显毒性，可以用于外源细胞因子等诱导的细胞增殖检测，以及药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测，是MTT检测方法的升级版。 本试剂盒使用便捷，无需配制或稀释，无需收集或洗涤细胞，无需对甲臜化合物进行再次溶解，对贴壁细胞及悬浮细胞均适用。且酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

产品信息

CCK-8使用说明

1.制作标准曲线(测定细胞具体数量)

(1)先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。

(2)按比例(例如：1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。

(3)接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。)

2.细胞活性检测

(1)在96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃,5% CO2)。

(2)向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

(3)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

(4)用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

(5)若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

3.细胞增殖-毒性检测

(1)在96孔板中配制100 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃， 5% CO2)。

(2)向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质。

(3)将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如：6、12、24或48小时)。

(4)向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

(5)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

(6)用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

(7)若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

4.活力计算

细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[ A(0 加药)-A(空白)]×100

A(加药)：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和 CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0 加药)：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

CCK-8试剂盒注意事项

1.本试剂盒检测原理是依赖于脱氢酶催化的反应，样品中如有较多还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，需设法去除。

2.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

3.白细胞可能需要培养较长时间。

4.当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1 ,000 个/孔 (100 µL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 ( 100 µL 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。

5.如果没有 450 nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 检测灵敏度最高。

6.培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

7.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈 最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液;另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸 发。

8.加检测试剂时避免产生气泡，否则会干扰检测结果。

9.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

10.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床、家庭及其他用途。