THP-1细胞M1极化试剂盒

产品描述

由研发团队精心研制的THP-1细胞M1极化试剂盒，包含适合THP-1细胞的扩增培养基、M0诱导培养基、M0静息维持培养基、M1极化培养基。本产品适用于THP-1细胞M0/M1极化，大量细胞培养数据验证，本产品可稳定、高效诱导上述细胞分化为M1型巨噬细胞。

注意：本产品仅提供给进一步科研使用，不可用于临床治疗等其他用途。

试剂盒组成信息

表1. 试剂盒组成信息

质量控制

通过细菌、真菌、支原体、内毒素检测。

通过渗透压、pH检测。

通过产品性能检测

处理原则

1.严格的无菌环境。务必保证实验室整体和操作区域的清洁。

2.规范的操作方式。请按照产品说明书描述的方式操作，严格控制变量，做好对照实验。

3.各成分需按照保存条件妥善存放，并尽快使用。

4.若短期内无法用完整套培养基，应按套装内各成分体积比例分批配制并分装保存。

产品稳定性及保存条件

1.套装内所有成分均需避光保存。

2.套装内专用培养基和维持培养基需置于4℃冰箱保存，保质期为3个月;其他成分需置于-20℃保存，保质期为3个月。

3.配制后的完全培养基，需放置4℃保存，保质期为1周;若能保证培养条件稳定，容器密封性能良好，避免冷热交替，则保质期可适当延长，但不得超过15天。

4.所有产品请于保质期内使用;过期的成分可能严重影响培养效果。

诱导培养基的配制

所需材料

1.THP-1细胞M1极化试剂盒

2.清洁、无菌、质量稳定的一次性耗材(6孔板/6 cm皿、移液管、移液器吸头、离心管等)

3.洁净的封口膜

操作步骤

1.配制前至少30 min，将套装中THP-1细胞诱导因子(以下简称因子)放置于4℃冰箱内，直至完全融化。

2.上下颠倒或轻弹试剂管以混匀试剂，混匀后，瞬时离心，保证试剂聚集在离心管底部。

3.用75%医用酒精仔细擦拭所有成分外包装。在超净台内打开包装。

4.将因子全部加入THP-1细胞专用培养基(以下简称专用培养基)中。

5.取少量专用培养基，洗涤添加物的试剂管，尽可能将所有成分全部加入基础培养基中。若需配制小规格的诱导分化培养基，可以按照比例进行配制。例如：需要配制10 mL的M0诱导培养基，即10 mL的THP-1细胞专用培养基+100 μL的M0诱导因子A;需要配制10 mL的M1极化培养基，即10 mL的THP-1细胞专用培养基+100 μL的M1极化因子A+100 μL的M1极化因子B。

6.拧紧基础培养基瓶盖，轻柔并充分摇匀。

7.用封口膜密封瓶口，用铝箔纸包裹瓶身，并标注名称、配制日期等信息。

特别提醒

1.若短期内无法用完全部培养基，我们建议分批配制;请按照套装内各成分比例，配制所需量;但剩余的成分必须严格按照各自的保存条件妥善保存，并且不可多次冻融。

2.该诱导极化试剂盒内的所有成分都严格控制无菌，一般情况下我们不建议再次除菌。若配制过程有污染风险，可将完全培养基过滤除菌。

诱导分化操作流程

所需材料

1.配制好的THP-1 M0诱导培养基、M0静息维持培养基、THP-1 M1极化培养基

操作步骤

注意：1)本操作规程以六孔板为例，请根据实际情况选用合适的培养容器;

2)诱导培养基在使用前均需恢复至室温使用。

M0诱导：

①取生长状态良好的THP-1细胞，300 g，离心3 min去上清。

②使用THP-1细胞M0诱导培养基调整细胞密度至5×105/mL。按分组进行细胞铺板，6孔板中每孔加入2 mL细胞悬液，6 cm培养皿中每皿加入5 mL细胞悬液。十字法摇后置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h，镜下可以观察到M0细胞呈圆形贴壁。

M1巨噬细胞极化：

①将M0诱导后的THP-1细胞，去除M0诱导培养基，用PBS溶液进行浸洗1-2遍，加入M0静息维持培养基进行饥饿处理24 h。(6孔板中每孔2 mL，6 cm培养皿中每皿5 mL)。

②去除M0静息维持培养基，加入适量的THP-1 M1极化培养基，轻轻吹打混匀，置于37℃ 5% CO2培养箱中继续培养48 h。诱导成功可以看到THP-1细胞变成巨噬状的细胞。

细胞的收集和检测

所需材料

1.Phosphate-BufferedSaline(1×PBS)

2.0.25%胰蛋白酶溶液(不含EDTA)

3.10%FBS的1640完全培养基

操作步骤

1. 镜下观察细胞状态，M1和M2极化细胞上清液收集可用于检测ELISA，取完上清液后使用PBS浸洗3次。

2. 每孔加入足量的0.25%胰蛋白酶溶液(不含EDTA)，置于37℃、5%CO2培养箱中消化30-60 s。

3. 使用1 mL移液器轻轻吹打细胞，促进细胞脱落，迅速加入10%FBS的1640完全培养基终止细胞消化，轻轻吹打并收集细胞到15 mL离心管中，100-250×g离心3-5 min，弃上清。

4. 将获得的细胞进行qPCR提取验证。

诱导前后对比图

M1诱导后鉴定

ELISA结果显示，与M0组相比，M1诱导组的IL-6蛋白分泌量显著升高(*p<0.05);qPCR结果进一步证实，M1组IL-6和TNF-α的mRNA表达水平较M0组均极显著上调(****p<0.0001)。

上述结果表明，巨噬细胞成功向M1型极化，获得了具有促炎特征的 M1 型巨噬细胞。