骨髓微环境反应性聚合物药物/siRNA调控白血病干细胞，有助于预防AML复发

基本信息

英文标题：Bone marrow microenvironment-responsive polymeric-drug/siRNA regulates leukemia stem cells assisting for prevention of AML relapse

中文标题：骨髓微环境响应性聚合物-药物/siRNA调控白血病干细胞，助力预防AML复发

发表期刊：《Biomaterials》

影响因子：12.9

作者单位：中山大学药学院(深圳)、中山大学药学院(广州)、中山大学实验动物中心

作者信息：

Shihong Cheng, Xiaohan Kong, Yiqiu Zhang, Jianing Gong, Han Wang, Wei Duan, Chujie Li, Xiyan Wang, Yan Xiao, Qiyue Wang, Yang Liu

研究背景

急性髓系白血病(AML)的现状与挑战

AML是一种恶性血液肿瘤，预后较差，主要原因是现有疗法难以有效靶向白血病干细胞(LSCs)。LSCs能够迁移至骨髓的缺氧微环境中，逃避化疗药物的杀伤并维持其干细胞特性，导致疾病复发。

LSCs的耐药机制

LSCs通过CXCR4/CXCL12轴归巢至骨髓微环境，并依赖线粒体自噬(mitophagy)维持其干细胞特性。抑制CXCR4/CXCL12轴或线粒体分裂蛋白Fis1的表达可削弱LSCs的耐药性。

研究创新点

设计了一种骨髓微环境响应性聚合物-药物/siRNA递送系统(PPLFazo/siFis1@C)，能够精准共递送CXCR4拮抗剂plerixafor和靶向Fis1的siRNA。

通过抑制CXCR4/CXCL12轴和下调Fis1表达，阻断LSCs迁移并抑制线粒体自噬，从而削弱LSCs的干细胞特性。

研究方法

纳米复合物的设计与合成

合成含偶氮苯连接子的聚合物PPLFazo，用于负载siFis1。

通过肽涂层(C)增强骨髓靶向性，涂层序列为DDDDDDPVGLIGDDDDDD，可被骨髓中高表达的MMP-2和Ca²⁺响应性降解。

体外实验

细胞摄取实验： 通过流式细胞术和共聚焦显微镜验证PPLFazo/siFis1@C在白血病细胞(C1498和KG-1)中的摄取效率。

基因沉默效率： 通过RT-qPCR和Western blot检测Fis1 mRNA和蛋白的表达水平。

线粒体自噬抑制： 通过JC-1染色和LC3-II/LC3-I比值评估线粒体膜电位和自噬水平。

体内实验

骨髓靶向性： 通过荧光成像验证PPLFazo/siFis1@C在AML小鼠模型中的骨髓富集能力。

治疗效果： 联合化疗药物mitoxantrone，评估对肿瘤生长、脾脏重量、白细胞计数和生存期的影响。

LSCs清除： 通过流式细胞术检测骨髓中CD33⁺和CD47⁺细胞的比例，评估LSCs的清除效果。

实验结果

图1：PPLFazo/siFis1@C在骨髓微环境中调控LSCs以联合化疗预防AML复发的制备原理、靶向机制及治疗效果示意图

(a) PPLFazo/siFis1@C的制备流程。

(b) 该药物通过调控LSCs迁移、削弱其干性特征，并增强化疗药物的细胞毒性作用，从而有效预防AML复发。

(c) PPLFazo/siFis1@C在骨髓微环境中响应性脱离包被的特性，以及其对LSCs的双重治疗调控机制。

图2：PPLFazo/siFis1@C纳米颗粒的制备与表征

(a) 通过琼脂糖凝胶电泳评估不同质量比(w/w = PPLFazo：siRNA)下PPLFazo/siFis1的凝聚效率。

(b) 不同凝聚比下PPLFazo/siFis1的粒径分布。

(c) 质量比= 20：1时PPLFazo/siFis1和PPLFazo/siFis1@C的粒径分布。

(d) PPLFazo/siFis1和PPLFazo/siFis1@C的透射电镜图像.

(e) PPLFazo/siFis1和PPLFazo/siFis1@C的Zeta电位。比例尺为200纳米。

(f) PPLFazo/siFis1和PPLFazo/siFis1@C在37◦C PBS中孵育48小时后的粒径变化。

(g) 通过琼脂糖凝胶电泳评估PPLFazo/siFis1和PPLFazo/siFis1@C在50 %血清条件下的siRNA稳定性。

(h) 不同浓度PPLFazo和PPLFazo/siFis1处理的3T3细胞活力检测。

图3：C1498细胞对不同纳米颗粒摄取的流式细胞术分析

单向荧光强度分析(a)和直方图(b) (n = 3，数据以均值±标准差表示)显示C1498细胞在不同孵育时间下对PPLFazo/siFis1的摄取情况。单向荧光强度分析(c)和直方图(d) (n = 3，数据以均值±标准差表示)展示低CXCR4表达的C1498细胞对不同纳米颗粒的摄取情况。单向荧光强度分析(e)和直方图(f) (n = 3，数据以均值±标准差表示)呈现正常C1498细胞对不同纳米颗粒的摄取情况。单向荧光强度分析(g)和直方图(h) (n = 3，数据以均值±标准差表示)则显示高CXCR4表达的C1498细胞对不同纳米颗粒的摄取情况。

图4：

低CXCR4表达C1498细胞、正常C1498细胞及高CXCR4表达C1498细胞中游离siRNA与不同纳米颗粒的细胞摄取及溶酶体逃逸能力共聚焦成像。(蓝色为Hoechst 33342染色，绿色为Lysotracker green标记的溶酶体，红色为Cy5.5染料偶联siRNA(Cy5.5-siRNA)，比例尺为20μm)(关于图例中颜色标注的解释，请读者参阅本文网络版)。

图5：不同纳米颗粒在C1498细胞中对Fis1基因敲低能力的评估及线粒体自噬抑制效果

(a) RT-qPCR检测C1498细胞经不同处理后Fis1 mRNA水平变化(数据以均值±标准差表示，n = 3，采用Student‘s t检验分析统计学差异)。

(b) Western blot检测C1498细胞经不同处理后Fis1表达水平变化。

(c) Western blot检测C1498细胞线粒体蛋白中LC3表达水平变化。

(d) 使用ImageJ软件对(c)中LC3-II/I表达水平进行半定量分析。

(e) JC-1标记的C1498细胞线粒体膜电位共聚焦显微图像(绿色代表JC-1单体，红色代表JC-1聚集体，比例尺为20 μm)。

(关于图例中颜色标注的解释，请参阅本文网络版)

图6：PPLFazo/siFis1@C在急性髓系白血病(AML)小鼠中的生物分布及骨髓靶向效果

(a) AML小鼠纳米颗粒分布实验的时间安排。

(b) 不同治疗组AML小鼠离体器官荧光成像结果，荧光信号来源于Cy5.5标记的siRNA。

(c) 离体荧光成像结果的半定量统计分析(n = 4)。

图7：PPLFazo/siFis1@C在AML小鼠模型中的治疗方案及初始疗效。

(a) 药效学评估的治疗方案。

(b) 股骨Fis1蛋白免疫组化染色结果(上排)、各组小鼠股骨照片(下排)及(c)不同治疗组小鼠脾脏H&E染色图像。

(c) 通过ImageJ软件对(b)中Fis1免疫组化结果进行半定量统计(n = 4).

(d) 不同治疗组小鼠脾脏重量对比(n = 4).

(e) 不同治疗组小鼠脾脏照片。

(f) 治疗期间静脉血白细胞计数(n = 4).

(g) 不同治疗组AML小鼠生存曲线(n = 9).

(h) 实验期间不同治疗组AML小鼠体重监测仪数据。数据以均值±标准差表示。统计学显著性采用非配对t检验，每根柱状图代表均值±标准差，每个数据点为独立样本的测量值。

图8：PPLFazo/siFis1@C在AML小鼠中的基因敲低及LSCs清除效率。

(a) 通过RT-qPCR分析不同处理下小鼠骨髓组织中Fis1 mRNA水平变化(数据以均值±标准差表示，n = 3，采用Student‘s t检验进行统计学分析)。

(b) 通过Western blot检测不同处理下小鼠骨髓组织中Fis1表达水平变化。

(c) 通过JC-1标记的流式细胞术分析骨髓组织线粒体膜电位(数据以均值±标准差表示，n = 4). (d)通过Western blot检测不同处理下骨髓组织线粒体蛋白LC3表达水平变化。

(e-f) 定量流式细胞术分析AML小鼠骨髓组织中髓系细胞标志物CD33信号(数据以均值±标准差表示，n=4).

(g-h) 定量流式细胞术分析AML小鼠骨髓组织中白血病干细胞标志物CD47信号(数据以均值±标准差表示，n = 4)。

图9：不同治疗方案对急性髓系白血病(AML)复发的抑制效果评估。

(a) 治疗时间安排及AML复发检测流程。

(b) AML小鼠骨髓组织中髓系细胞标志物CD33信号的流式细胞术分析。

(c) AML小鼠骨髓组织中髓系细胞标志物CD47信号的流式细胞术分析。

(d-e) CD33+和CD47+细胞流式分析结果的定量统计学分析。采用非配对t检验评估P值(数据以均值±标准差表示，n = 4)。

(f) 不同治疗方案下AML小鼠治疗结束至第40天的白细胞计数变化(n = 3)。

(g) 小鼠从第20天至第40天的体重变化情况(n = 4)。

图10：马托蒽醌剂量优化联合治疗的药效学评估。在AML小鼠模型中，将马托蒽醌剂量增至4 mg/kg，并分别进行单独给药或联合PPLFazo/siFis1@C治疗。

(a) 通过流式细胞术检测骨髓细胞中的髓系细胞标志物CD33信号，评估不同治疗方案对AML小鼠的影响。

(b) 检测骨髓细胞中白血病干细胞标志物CD47信号，评估不同治疗方案对清除骨髓中LSCs的效果。

(c)(d) 分别为(a)和(b)的定量分析结果(数据以均值±标准差表示，n = 4)。

(e) 马托蒽醌剂量增至4 mg/kg后，不同治疗方案对AML小鼠的生存曲线(n = 9)。

研究结论

体外实验结果：

PPLFazo/siFis1@C显著抑制Fis1表达，降低线粒体自噬水平。在缺氧条件下，PPLFazo/siFis1@C能够高效释放siRNA并实现基因沉默。

体内实验结果：

PPLFazo/siFis1@C在骨髓中显著富集，并有效下调Fis1表达。联合mitoxantrone治疗后，AML小鼠的肿瘤负荷显著降低，生存期延长。流式分析显示，PPLFazo/siFis1@C-Mit组骨髓中CD33⁺和CD47⁺细胞比例显著减少。

创新策略： 通过骨髓微环境响应性纳米递送系统，实现LSCs的双重调控(迁移抑制和干细胞特性削弱)。

转化意义： 为AML复发预防提供了新型联合治疗策略，并展示了聚合物-siRNA纳米复合物的临床潜力。