突破！新型体外模型可同时感染四种肝炎病毒，助力抗病毒研究

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：A novel in vitro system for simultaneous infections with hepatitis B, C, D and E viruses

中文标题：一种可同时感染乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒的新型体外系统

发表期刊：《JHEP Reports》

影响因子：7.5

作者单位：

1. CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Univ Lyon, Inserm, U1111, Université Claude Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, ENS de Lyon, F-69007, Lyon, France

2. Université de Strasbourg, Inserm, Institut de Recherche sur les Maladies Virales et Hépatiques UMR_S1110, Strasbourg, France

3. Laboratory of Liver Infectious Diseases, Department of Diagnostic Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, Ghent, Belgium

作者信息：

Roxanne Fouillé, Eloi R. Verrier, Amse De Meyer

研究背景

02乙型(HBV)、丙型(HCV)、丁型(HDV)和戊型(HEV)肝炎病毒可感染肝细胞，慢性感染可导致终末期肝病，但目前缺乏能同时支持四种病毒共感染的体外模型，限制了对病毒间相互作用及抗病毒药物交叉反应的研究。本研究建立了一种新型体外模型：通过 2% DMSO 处理 HuH7.5-NTCP 细胞，使其部分分化为肝细胞样细胞(dHuH7.5-NTCP)，该细胞可支持四种病毒的单一及多重感染，并验证了法尼醇 X 受体(FXR)激动剂的广谱抗病毒活性，为肝炎病毒共感染研究和广谱抗病毒药物筛选提供了工具

研究方法

细胞分化：HuH7.5-NTCP 细胞经 2% DMSO 处理 1 周，诱导为肝细胞样细胞(dHuH7.5-NTCP)，通过 RNA 测序、Western blot 检测肝脏特异性基因(如白蛋白、HNF4α)和蛋白表达，评估分化状态;检测 VLDL 分泌功能及先天免疫反应能力。

病毒感染与检测：用 HBV、HCV、HDV、HEV 单一或混合感染 dHuH7.5-NTCP 细胞，通过多重 RT-ddPCR 定量病毒 RNA，Western blot 和化学发光免疫分析(CLIA)检测病毒蛋白(如 HDAg、HCV NS5A、HEV ORF2)，监测病毒复制至少 4 周。

抗病毒药物测试：在感染细胞中测试已知药物(sofosbuvir、IFN-α)及 FXR 激动剂(GW4064、vonafexor)的效果，通过 RT-qPCR 检测病毒 RNA 水平;在 HuHep 小鼠中验证 vonafexor 对 HEV 的抑制作用。

实验结果

图1：DMSO 处理诱导 HuH7.5-NTCP 细胞分化为肝细胞样细胞

A-B 图显示 DMSO 处理后，细胞中肝脏特异性基因(如参与药物代谢、胆汁酸合成)表达上调(Z-score 升高)，细胞周期相关基因下调;

C 图 Western blot 证实 dHuH7.5-NTCP 表达白蛋白、HNF4α(肝细胞标志物)，但 CYP34A/P450(解毒酶)水平低于原代肝细胞(PHH)和分化的 HepaRG 细胞;

D 图显示 dHuH7.5-NTCP 分泌 ApoB-containing VLDL(肝细胞脂质代谢功能)，水平接近 PHH;

E 图显示 dHuH7.5-NTCP 经 RLR 配体和 IFN-α 刺激后，RSAD2(ISG)表达上调，但 TLR 配体刺激无反应(先天免疫功能部分恢复)。

结果证实 dHuH7.5-NTCP 具有肝细胞样表型和功能。

图2：dHuH7.5-NTCP 支持四种肝炎病毒的单一及共感染，并对广谱抗病毒药物敏感

A 图多重 RT-ddPCR 显示，dHuH7.5-NTCP 可支持 HBV、HCV、HDV、HEV 单一或共感染，病毒 RNA 至少持续 4 周;

B 图 Western blot 和 CLIA 证实病毒蛋白(如 HDAg、HCV NS5A、HEV ORF2)表达及 HBeAg 分泌;

C-D 图显示 sofosbuvir 抑制 HCV 和 HEV(>90%)，IFN-α 抑制 HCV、HDV、HEV(80%)，FXR 激动剂 GW4064 和 vonafexor 抑制 HBV、HDV 和 HEV(85-95%)，对 HCV 无影响;

E 图 HuHep 小鼠实验证实 vonafexor 可降低 HEV 粪便载量。

结果表明该模型可用于病毒相互作用研究和广谱抗病毒药物筛选。

研究结论

本研究建立的 dHuH7.5-NTCP 细胞模型可支持 HBV、HCV、HDV、HEV 的单一及多重感染，且病毒复制可持续至少 4 周，为研究肝炎病毒间相互作用提供了工具。该模型验证了已知抗病毒药物的特异性，并发现 FXR 激动剂(如 vonafexor)具有广谱抗 HBV、HDV、HEV 活性，为共感染患者的治疗提供了新方向。