UBE3A缺失对人类大脑类器官神经元和非神经元细胞的影响研究

UBE3A是位于人类15号染色体的印记基因，在大多数组织中双等位基因均表达，但在神经元中由于父系等位基因的表观遗传沉默，只有母系等位基因活跃。母系UBE3A功能缺失导致神经元中UBE3A蛋白缺乏，这是引起天使综合征(Angelman Syndrome, AS)的常见病变，AS是一种以智力障碍、语言障碍、共济失调和癫痫为特征的神经发育障碍。此外，UBE3A过表达还与Dup15q和自闭症谱系障碍等其他神经发育障碍有关，因此大脑中UBE3A的剂量对正常脑发育和功能至关重要。

以往研究主要关注UBE3A在神经元中的作用，这是因为UBE3A在神经元中印记，受影响的母系等位基因导致神经元中UBE3A蛋白几乎完全缺失。然而，实验和临床证据表明UBE3A失调可能具有更广泛的影响。除泛素连接酶活性外，UBE3A还参与转录调节并具有中心体功能。研究显示神经祖细胞中存在部分父系印记和神经前体细胞中异常的核UBE3A，表明UBE3A剂量改变的影响可能不限于神经元。此外，有研究表明UBE3A剂量对脑脊液具有潜在影响，脑脊液已知调节大脑的发育和稳态过程。人类大脑类器官可能是研究UBE3A生物学这些未充分研究方面的有用模型，因为它们包含了以前难以研究的细胞类型，提供了对人类分子和细胞生物学的接触途径。

近期，发布在communications biology期刊，题为Loss of UBE3A impacts both neuronal and non-neuronal cells in human cerebral organoids的文章揭示了UBE3A对未被研究的细胞类型和相关神经发育过程的影响，并阐明了潜在的治疗靶点。

图示描述

1) UBE3A缺失改变大脑类器官细胞类型组成：通过对H9WT和H9UBE3A m-/p-多能干细胞衍生的6周大脑类器官进行单细胞RNA测序，研究鉴定出15种细胞类型，主要包括径向胶质细胞(RG)、中间祖细胞(IP)、间充质细胞、脉络丛(ChP)、RSPO+细胞和神经元。H9WT类器官表现出更高比例的较不成熟、增殖性细胞类型(增殖RG和增殖IP)，而H9UBE3A m-/p-类器官含有更多成熟细胞如兴奋性神经元。这些组成差异表明UBE3A缺失可能限制祖细胞池并导致祖细胞过早退出多能性并向兴奋性神经元谱系分化。

图1 缺乏UBE3A会改变人脑类器官的细胞类型组成

2) UBE3A缺失破坏祖细胞增殖和玫瑰花结构：差异基因表达分析显示UBE3A缺失影响了4206个差异表达基因，其中兴奋性神经元、径向胶质细胞和增殖RG表现出最多的差异表达基因。通路分析揭示UBE3A缺失影响了多种与皮质发生和神经发生相关的通路。EdU增殖实验证实H9UBE3A m-/p-和H9UBE3A m-/p+类器官的EdU阳性细胞百分比显著低于H9WT，表明不仅UBE3A缺失，UBE3A剂量减少也会导致胚胎体祖细胞增殖减少。此外，H9UBE3A m-/p-类器官明显小于H9WT类器官，并且皮质祖细胞标记物EMX1在UBE3A缺失时几乎完全丢失。

图2 H9WT与H9UBE3A m−/p−类器官在基因表达上表现出细胞类型特异性差异

3) 皮质样神经元发育受损：11周类器官的单细胞RNA测序分析显示，与6周相比存在更大的组成差异。在UBE3A缺失的情况下，类器官含有更多的兴奋性神经元、神经元、脉络丛、RG/ChP和间充质细胞，而皮质层样神经元(EN-CL)、增殖RG细胞则较少。最显著的是，皮质层样神经元在H9UBE3A m-/p-类器官中基本缺失。差异表达分析显示EN-CL包含许多与突触、轴突和树突发育、细胞迁移相关的高表达基因，这与之前关于UBE3A对这些细胞功能影响的文献报告一致。

4) 脉络丛细胞过度生成：研究观察到UBE3A缺失导致类器官中脉络丛细胞比例增加，并且出现了两种不同的形态学表型：大的充液囊泡和蜿蜒的组织，这两种都是含有脉络丛组织的类器官的特征。UBE3A剂量似乎控制这两种形态的平衡，H9WT含有囊泡，H9UBE3A m-/p-含有蜿蜒组织，H9UBE3A m-/p+两种形态都有。通路分析显示UBE3A缺失影响了脉络丛细胞中许多WNT相关通路、昼夜节律、自噬和线粒体相关通路的表达。时空定位研究显示UBE3A在早期类器官的TTR+脉络丛样区域上皮细胞中表现出强烈的核定位，但这种模式在较老的7周类器官中消失。

图3 UBE3A蛋白缺失会破坏神经祖细胞增殖与脑室区放射状胶质纤维结构

5) 代谢通路靶向可能挽救祖细胞池缺陷：基于通路分析结果，研究筛选了26种抑制剂来靶向受UBE3A缺失影响的通路。结果显示几种抑制剂能够增加H9UBE3A m-/p-类器官的大小，包括靶向mTORC、JAK和WNT通路的小分子化合物。其中，雷帕霉素处理的类器官显示出更清晰的玫瑰花结构形成，表明可能挽救了祖细胞池及其有组织的增殖。免疫染色显示雷帕霉素处理相比载体对照组产生了更有组织的祖细胞结构。

6) HH-GLI3-EMX1轴的调节机制：研究提出UBE3A可能通过HH-GLI3-EMX1轴负性调节信号传导，导致皮质发生破坏。GLI3是径向胶质标记物，已被报告在背侧端脑发育过程中位于EMX基因上游。通路分析显示在RG、增殖RG和兴奋性神经元细胞中HH信号传导下调。研究观察到UBE3A缺失时GLI3在转录和蛋白水平的表达都较低，表明UBE3A可能通过影响GLI3表达在EMX1上游发挥作用。

图4 潜在UBE3A相关通路的机制性探索

全文总结

本研究系统性地揭示了UBE3A对发育中大脑的多方面和广泛影响，远超过此前主要关注的成年神经元突触功能。研究证明UBE3A缺失通过直接影响神经干细胞和祖细胞增殖来调节大脑的整体组成平衡和大小，这可能与天使综合征中观察到的小头畸形以及神经元亚型失衡有关。更重要的是，研究发现UBE3A参与皮质发生的调节，特别是通过HH-GLI3-EMX1轴影响皮质祖细胞的发育，为理解天使综合征的皮质活动和结构改变提供了新的机制见解。

此外，研究报告了UBE3A与脉络丛生成和功能的潜在联系，这对理解自闭症谱系障碍个体中观察到的脑脊液体积差异具有重要意义。脉络丛调节重要调节因子的清除和分泌，UBE3A的影响可能对天使综合征患者具有重要的临床意义。研究还通过小分子抑制剂筛选发现靶向mTORC、JAK和WNT通路可能挽救UBE3A缺失引起的表型，为天使综合征的治疗提供了新的策略方向。