人类端脑类器官的新方法及其在神经发育研究中的应用

人类大脑发育具有多个独特特征，包括延长的神经发育期、神经细胞的广泛多样性和复杂性、人类特异性基因的表达以及神经元和神经网络的独特功能特性。这些人类特异性的神经发育特征在动物模型中难以复现，因此需要基于人类的模型来研究正常和病理条件下的人类大脑发育。传统的人类胎儿脑组织研究虽然有效，但存在获取困难、不易进行遗传操作等局限性。现有的人类多能干细胞衍生的端脑类器官技术虽然能够重现人类胎儿端脑发育的许多重要特征，但仍存在显著局限性，包括细胞组成和组织结构的变异性、人类特异性神经祖细胞和晚期皮层神经元分化受损、皮层分层紊乱以及神经元和神经网络功能成熟不良等问题。这些局限性主要源于传统方法使用多个神经管样结构(neural rosettes)生成类器官，导致组织结构不可预测和细胞组成不一致。

2025年6月27日，发表在Nature Protocols上题为Generating and characterizing human telencephalic brain organoids from stem cell-derived single neural rosettes的研究开发了一种从单个神经管样结构(neural rosettes)生成人类端脑类器官的新方法。该方法通过从单个神经管样结构开始，生成具有可预测组织结构和可重复细胞组成的端脑类器官。与传统方法相比，单个神经管样结构衍生的类器官具有更一致的细胞组成和功能神经网络，能够更好地模拟人类大脑发育过程。此外，本研究还提供了详细的实验步骤和优化方案，包括单细胞RNA测序、免疫组化和切片膜片钳电生理学等下游分析方法，以全面表征类器官的细胞组成和功能特性。

研究结果

1，单神经管样结构的特征和选择标准。

研究团队成功建立了从人类多能干细胞分离单个神经管样结构(SNR)的方法。SNR是自组织的三维多细胞结构，由径向分布在中央腔室周围的神经上皮细胞和径向胶质细胞组成。研究发现，直径为200-300μm且具有清晰可见单一腔室的SNR是生成成功类器官的关键。较小的SNR(<150μm)往往无法转化为类器官并在悬浮培养中生长，而从多个神经管样结构簇中分离的SNR经常转化为具有多个腔室的类器官。通过免疫荧光染色证实，SNR中的细胞表达增殖标记物pH3和KI67、神经祖细胞标记物SOX2和NESTIN以及端脑标记物PAX6和FOXG1，确认了其端脑特性。

2，类器官的发育和成熟过程。

分离的SNR在低黏附96孔板中培养2周后，大多数SNR的直径增长到400-700μm，并转化为具有单一腔室的类器官。研究发现FGF2对于支持类器官生长至关重要，类器官的大小与腔室数量之间没有相关性。为促进进一步的组织生长，研究团队采用Matrigel(MG)包埋技术，观察到显著的组织转化，包括大量组织生长、细胞向MG迁移和纤维的广泛辐射。类器官在MG中继续扩张4个月，到诱导后约5个月时直径达到3-5mm。在3-4个月后，研究团队使用脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT3)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)处理类器官，以促进神经元存活、成熟和突触发育。

3，细胞组成的可重复性和多样性。

通过单细胞RNA测序分析，研究团队证实了1个月龄SNR衍生类器官具有高度可重复的细胞组成。类器官主要由端脑神经祖细胞以及兴奋性和抑制性神经元组成，这使得研究团队能够研究发育中端脑不同类型神经祖细胞和神经元的分化规律。利用基于scRNA-seq的计算谱系追踪技术，研究团队识别了与从共同未分化神经祖细胞池中兴奋性和抑制性神经谱系分化相关的信号通路。5个月龄类器官显示出更加多样化的神经细胞类型，包括兴奋性和抑制性神经祖细胞、深层和浅层皮层兴奋性神经元、LGE衍生的抑制性中间神经元、原发性纹状体抑制性神经元，以及星形胶质细胞、少突胶质细胞、血管周细胞和室管膜细胞。

4，组织结构的可预测性。

研究显示，SNR衍生类器官表现出相对于SNR的可预测组织结构。在5个月龄类器官中，室管膜细胞排列在腔室内，皮层兴奋性神经元表现出分层现象，原发性纹状体抑制性神经元主要分布在皮层下方。这些结果表明，5个月龄SNR衍生类器官可用于研究皮层分层以及胶质细胞、血管周细胞和室管膜细胞的分化。免疫组织化学分析进一步证实了这种可预测的细胞组织。神经祖细胞表达SOX2、PAX6、pVIM和pH3等标记物，主要位于紧邻腔室的脑室样区域，而表达MAP2的神经元分布在脑室样区域外围的更周边区域。

5，功能特性和电生理活性。

5个月龄SNR衍生类器官中的神经元展现出显著的功能成熟度。通过膜片钳电生理学实验，研究团队发现类器官中含有相当大比例的功能成熟神经元，这些神经元能够产生动作电位，接受兴奋性和抑制性突触输入，并展现出功能性神经网络。神经元表现出多样化的电生理特性，包括不同的动作电位发放模式，表明类器官中存在不同类型的成熟神经元。此外，类器官中的细胞表达突触和活动调节基因，显示点状突触蛋白定位，并且许多细胞表达灵长类特异性活动调节基因OSTN以及与孤独症和精神分裂症相关的基因，表明其在研究神经元活动和精神疾病建模方面的潜力。

6，疾病建模应用。

研究团队成功使用CRISPR-Cas9技术在人类干细胞中引入SHANK3基因的杂合缺失(约69.5 kB)，建立了孤独症谱系障碍的疾病模型。通过比较正常和SHANK3缺陷的SNR衍生类器官，研究团队能够识别与神经发育异常相关的细胞和分子机制。这一应用验证了SNR衍生类器官在疾病建模中的价值，特别是在研究大型基因缺失对人类大脑发育影响方面的独特优势。

全文总结

本研究开发的基于单神经管样结构的人类端脑类器官生成方法具有重要的科学意义和应用价值。首先，该方法显著提高了类器官的可重复性和可预测性，为神经发育研究提供了更加标准化和可靠的模型系统。其次，SNR衍生类器官能够更好地重现人类端脑发育的关键特征，包括细胞类型多样性、组织结构和功能网络形成，为理解人类特异性神经发育机制提供了重要工具。此外，该方法在疾病建模方面展现出巨大潜力，特别是在研究孤独症、精神分裂症等神经发育疾病的细胞和分子机制方面。研究团队成功建立的SHANK3缺陷模型证明了该技术在研究大型基因缺失对人类大脑发育影响方面的独特优势。最后，功能成熟的神经网络和电生理活性使得这些类器官有望应用于药物筛选、治疗策略开发以及新型生物计算系统的构建，为神经科学研究和临床转化提供了新的平台。