密码子优化不只是“优化翻译”研究发现它竟通过染色质可及性影响基因表达

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：DNA Sequence Changes Resulting from Codon Optimization Affect Gene Expression in Pichia pastoris by Altering Chromatin Accessibility

中文标题：密码子优化导致的 DNA 序列变化通过改变染色质可及性影响毕赤酵母的基因表达

发表期刊：《Journal of Fungi》

影响因子：4

作者单位：

State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

作者信息：

Chaoyu Lu, Linna Guo, Bohao Fang, Jiacheng Shi, Mian Zhou

研究背景

密码子优化是提高蛋白质表达的常用策略，但部分基因优化后会出现意外的转录抑制，且机制不明。本研究以毕赤酵母(Pichia pastoris)中的两个基因(0432 和 Fluc)为模型，发现其密码子优化后 mRNA 水平显著降低。通过组蛋白 H3 染色质免疫沉淀(ChIP)和 DNase I hypersensitivity 实验证实，转录抑制的基因序列表现出核小体占据增加和染色质可及性降低。这种变化不依赖启动子，更换强启动子(PGAP)为弱启动子(Ppor1、Prps8b)后，转录抑制和染色质可及性降低仍存在。研究挑战了 “密码子优化仅影响翻译” 的传统观点，揭示其可通过改变染色质可及性提前调控转录，为合成基因设计中避免意外转录沉默提供了新思路。

研究方法

以毕赤酵母 GS115 为宿主，选取内源基因 0432 和外源基因 Fluc(萤火虫荧光素酶)，通过密码子优化设计其优化序列(0432-opt、Fluc-opt)，利用 PCR 扩增或人工合成获取基因序列，构建含不同启动子(PGAP、Ppor1、Prps8b)的表达质粒，线性化后电转化至酵母细胞，验证单拷贝整合。通过 RT-qPCR 检测 mRNA 水平;ChIP 实验结合 qPCR 分析组蛋白 H3 和 H3K27me3 的富集(核小体占据标记);DNase I hypersensitivity 实验评估染色质可及性;插入终止密码子(0432-optTGA)验证是否存在提前转录终止。

实验结果

图1：密码子优化显著降低 0432 和 Fluc 的 mRNA 水平

A、B 图显示优化后两基因的密码子适应指数(CAI)从 0.6-0.8 升至 0.95-1.0(接近最优);

C、D 图 RT-qPCR 表明，优化序列(0432-opt、Fluc-opt)的 mRNA 水平在 ORF 各区域(P1-P9)均显著低于原始序列，且与引物位置无关。

结果证实密码子优化虽提高 CAI，却导致严重的转录抑制。

图2：0432-opt 的转录抑制并非由 AATAAA-like 基序介导的提前终止导致

A 图预测 0432-opt 存在 AATAAA-like 基序(潜在的转录终止信号);

B 图在 0432-opt 中插入 TGA 终止密码子(0432-optTGA)后，RT-qPCR 未检测到短 mRNA 积累，各区域 mRNA 水平仍显著低于原始序列。

结果排除提前转录终止为抑制原因，提示其他机制。

图3：密码子优化增加核小体占据，与 H3K27me3 修饰无关

A、B 图 ChIP-qPCR 显示，0432-opt 和 Fluc-opt 的组蛋白 H3 富集显著高于原始序列，表明核小体密度增加;

C 图 Fluc-opt 的 H3K27me3/H3 比值与原始序列无显著差异，排除表观沉默修饰的作用。

结果表明转录抑制与核小体占据增加直接相关。

图4：密码子优化降低染色质可及性

DNase I hypersensitivity 实验显示，0432-opt 和 Fluc-opt 的 DNA 保留率显著高于原始序列，表明染色质可及性降低(DNase I 难以切割紧密包装的 DNA)。

结合图3，证实核小体占据增加导致染色质压缩，阻碍转录 machinery 结合。

图5：转录抑制和染色质变化不依赖启动子

更换启动子为 Ppor1(A-C)和 Prps8b(D-F)后，Fluc-opt 仍表现出 mRNA 水平降低(A、D)、组蛋白 H3 富集增加(B、E)、染色质可及性降低(C、F)，与 PGAP 启动子下结果一致。结果表明，密码子优化导致的序列变化本身是染色质结构和转录异常的原因，与启动子类型无关。

研究结论

密码子优化通过改变基因 ORF 序列，增加核小体占据并降低染色质可及性，从而抑制毕赤酵母中的基因转录，且该效应不依赖启动子类型。这一发现突破了 “密码子优化仅影响翻译” 的传统认知，揭示其可通过染色质水平调控提前影响转录。研究提示，在合成基因设计中需整合染色质结构考量，以避免意外转录沉默，优化表达效率。