功能化碳纳米管免疫增强对模型抗原卵清蛋白的抗体应答

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：Immunization with functionalized carbon nanotubes enhances the antibody response against model antigen ovalbumin

中文标题：功能化碳纳米管免疫增强对模型抗原卵清蛋白的抗体应答

发表期刊：《Immunology Letters》

影响因子：2.8

作者单位：

State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China

作者信息：

Xinfeng Zhu, Jiadi Sun, Yinzhi Zhang, Xiulan Sun

研究背景

碳纳米管(CNTs)因独特的物理化学性质，在生物领域作为生物分子递送载体备受关注，但其作为免疫佐剂的作用机制尚未系统阐明。本研究通过共价偶联将模型抗原卵清蛋白(OVA)与功能化多壁碳纳米管(MWCNTs)结合，探究其增强免疫应答的机制。体外实验发现 MWCNT-OVA 可提高树突状细胞(DC2.4)的抗原摄取效率，上调共刺激分子(CD40/86)和 MHCII 分子表达;体内实验显示其能促进 IL-1β、TNF-α、IL-6 等细胞因子分泌，激活补体系统，且中等剂量 MWCNT-OVA 诱导的 OVA 特异性抗体滴度最高，与弗氏佐剂具有协同作用。研究证实功能化 MWCNTs 可通过多种途径增强体液免疫，为其作为疫苗佐剂的应用提供依据。

研究方法

通过 EDC/NHS 化学偶联法将 OVA 与酸化处理的 MWCNTs 结合，制备 MWCNT-OVA 复合物，利用紫外光谱、圆二色谱和透射电镜(TEM)表征偶联效果。体外实验中，以 DC2.4 和 RAW264.7 细胞为模型，通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞对 FITC 标记 OVA 的摄取效率，流式细胞术分析细胞表面分子(CD40、CD86、MHCII、CD11c)的表达，ELISA 检测 IL-1β、TNF-α、IL-6 等细胞因子分泌。体内实验中，将不同剂量的 MWCNT-OVA、OVA 单独及与弗氏佐剂联合免疫 BALB/c 小鼠，定期检测血清中 OVA 特异性 IgG 滴度，同时检测补体成分 C3 和 C5a 的水平，验证补体系统激活情况。

实验结果

图1：MWCNT-OVA 偶联物的表征

A 图紫外光谱显示 OVA 在 280 nm 有特征峰，MWCNT-OVA 在 250-280 nm 有蛋白特征峰，证实偶联成功;

B 图圆二色谱表明 OVA 与 MWCNTs 偶联后二级结构改变;

C 图为羧基化 MWCNTs 的稳定溶液;

D、E 图 TEM 显示酸化 MWCNTs(D)表面光滑，而 MWCNT-OVA(E)表面因 OVA 修饰更粗糙，束状结构更粗。结果验证了 OVA 与 MWCNTs 的成功偶联。

图2：DC2.4 细胞对 MWCNT-OVA 的摄取效率

A 图流式细胞术显示 FITC-OVA-MWCNT 组的荧光强度显著高于 FITC-OVA 组;

B-D 图共聚焦显微镜观察到 MWCNT-OVA 组细胞内绿色荧光(FITC-OVA)聚集更多，而单纯 OVA 组荧光较弱。结果表明 MWCNTs 可促进抗原呈递细胞对 OVA 的摄取，为增强免疫应答奠定基础。

图3：MWCNT-OVA 对 RAW264.7 细胞表面分子表达的影响

流式细胞术分析显示，RAW264.7 细胞经 MWCNT-OVA 处理 48 小时后，MHCII 分子表达显著上调，CD40 表达明显增强，CD86 表达略有升高，CD11c 表达也显著增加;而 OVA 单独处理对这些分子的表达影响较小。作为阳性对照的 LPS 处理组，48 小时后 CD86 表达略有下降(与文献中 LPS 长期处理的结果一致)。结果表明，MWCNT-OVA 可促进 RAW264.7 细胞的成熟与活化，通过上调抗原呈递相关分子(MHCII)和共刺激分子(CD40/86)，增强 T 细胞的识别与激活，进而促进体液免疫应答。此外，补充实验显示 DC2.4 细胞经 MWCNT-OVA 处理后，上述分子表达无显著变化，提示 MWCNTs 对不同抗原呈递细胞的作用存在特异性。

图4：MWCNT-OVA 对 RAW264.7 细胞炎症小体激活的影响

A 图细胞毒性检测显示，30 μg/mL 和 100 μg/mL 的 MWCNT-OVA 对 RAW264.7 细胞有一定毒性，而 OVA 单独处理无明显毒性;

B 图 ELISA 结果显示 MWCNT-OVA(100 μg/mL)显著诱导 IL-1β 分泌，OVA 单独处理诱导作用微弱;

C、D 图显示 MWCNT-OVA(30 μg/mL 和 100 μg/mL)可显著促进 TNF-α 和 IL-6 分泌。结果表明 MWCNT-OVA 可激活炎症小体，通过分泌促炎细胞因子增强免疫应答。

图5：不同免疫处理诱导的抗 OVA 抗体应答

各组小鼠在 37 d、52 d、67 d、82 d 的 OVA 特异性 IgG 滴度检测显示，MWCNT-OVA 各组抗体滴度均高于 OVA 单独组，其中中等剂量 MWCNT-OVA 在 82 d 时滴度最高;MWCNT-OVA 与弗氏佐剂联合组滴度高于单独 MWCNT-OVA 组，显示协同作用;MWCNT-KLH-MC-LR 组诱导的 MC-LR 特异性抗体滴度显著高于 KLH-MC-LR 组。结果证实 MWCNTs 可增强抗原特异性抗体应答，且剂量效应明显。

图6：MWCNT-OVA 对补体系统的激活

A 图显示 MWCNT-OVA 免疫组小鼠血清中 C3 水平低于 OVA 单独组;

B 图显示其 C5a 水平高于 OVA 单独组，且随时间延长持续升高。C3 的降低和 C5a 的升高提示补体系统被激活，说明 MWCNTs 可通过激活补体系统间接促进抗体产生。

研究结论

功能化多壁碳纳米管(MWCNTs)通过多种机制增强对模型抗原 OVA 的体液免疫应答：体外可促进抗原呈递细胞(DC2.4、RAW264.7)的抗原摄取，上调共刺激分子(CD40/86)和 MHCII 分子表达，诱导 IL-1β、TNF-α、IL-6 等细胞因子分泌;体内能激活补体系统(降低 C3、升高 C5a)，且中等剂量 MWCNT-OVA 诱导的 OVA 特异性抗体滴度最高，与弗氏佐剂具有协同作用。此外，MWCNTs 对小分子抗原(如 MC-LR)也有增强免疫应答的效果。这些结果表明功能化 MWCNTs 具备优良的佐剂特性，可通过抗原递送、免疫细胞激活、细胞因子分泌及补体系统激活等途径增强免疫应答，为其在疫苗开发中的应用提供了理论依据。