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空肠弯曲菌生物膜检测新方法:NanoLuc 荧光素酶技术助力食品安全监控

发布时间:2025-07-10 09:02:16 细胞资源库平台 访问量:7

在生物医学研究和药物开发领域,生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而,传统的荧光素酶种类有限,限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制,科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL),它源自深海虾Oplophorus gracilirostris,并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶,其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍,并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像,而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长,甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外,NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用,为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略,从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上,它还具有更小的尺寸,这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小,有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点,使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此,NanoLuc作为一种新的报告基因,不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究,而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题:Campylobacter jejuni Biofilm Assessment by NanoLuc Luciferase Assay

中文标题:空肠弯曲菌生物膜的 NanoLuc 荧光素酶检测方法

发表期刊:《Bio protocol》

影响因子:1.1

作者单位:

1. Department of Food Science and Technology, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia

2. Department of Biotechnology, Jožef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia

3. Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, Iowa State University, Ames, IA, USA

4. Department of Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, Iowa State University, Ames, IA, USA

5. Chair of Pharmaceutical Biology, Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia

作者信息:

Tjaša Čukajne1, Petra Štravs2, Orhan Sahin3

研究背景

Campylobacter jejuni 是一种广泛存在于鸟类和哺乳动物中的病原体,虽对环境和食品加工压力敏感,但其形成的生物膜可抵御温度波动、干燥、pH 变化等压力,是重要的生存机制。现有生物膜检测方法(如培养计数、染色法、PCR 等)常存在特异性、敏感性不足或不适合细胞定量等问题。NanoLuc 作为报告蛋白,具有分子小(19 kDa)、温度稳定性高(Tm=60°C)、发光效率高且无需 ATP 等优势,其催化底物氧化产生的发光信号可准确反映细胞代谢活性,已成功用于其他细菌生物膜监测,故本研究将其适配于空肠弯曲菌生物膜评估。

研究方法

实验采用经 pMW10_nLuc 质粒转化的 C. jejuni 81-176 菌株,在微需氧条件下(85% N₂、10% CO₂、5% O₂)于 96 孔板中培养生物膜,经 PBS 洗涤后加入 Nano-Glo 荧光素酶底物,测量生物发光信号。通过制备已知细菌浓度(1.9×10⁷至 1.5×10⁸ CFU/mL)的校准曲线,基于线性回归计算生物膜中的细菌浓度。实验需使用 MHB 培养基、PBS、Karmali 选择性添加剂等试剂,以及发光板读数仪、离心机等设备,并遵循 BSL-2 生物安全标准。

实验结果

图1:pMW10_nLuc 质粒示意图

图1:pMW10_nLuc 质粒示意图

展示了 pMW10_nLuc 质粒的结构,包括卡那霉素抗性基因(KanR)、启动子(porA)、核糖体结合位点(RBS)、NanoLuc 基因(nLuc)、转录终止子(TT)以及限制性酶切位点 BamHI 和 XbaI 等。

该质粒是用于转化空肠弯曲菌的关键载体,其中 nLuc 基因的表达使细菌能够产生 NanoLuc 荧光素酶,从而实现后续的生物发光检测。卡那霉素抗性基因用于筛选成功转化的菌株,启动子和核糖体结合位点确保 nLuc 基因的有效表达,转录终止子则保证转录的正确终止。

图2:空肠弯曲菌生物膜检测的代表性校准曲线

图2:空肠弯曲菌生物膜检测的代表性校准曲线

纵轴为相对光单位(RLU),横轴为菌落形成单位每毫升(CFU/mL),图中显示了两者之间的线性关系,相关系数 R²=0.9861。

校准曲线是该检测方法的重要基础,通过已知 CFU/mL 的细菌悬液稀释液测量其对应的 RLU 值,建立两者的线性关系。在实际检测中,可根据测得的生物膜样品的 RLU 值,利用该曲线计算出样品中的细菌浓度。高 R² 值(>0.95)表明该校准曲线具有良好的线性相关性,能够准确用于细菌浓度的计算。

研究结论

本研究建立的 NanoLuc 荧光素酶检测方法可快速(生物膜生长后 < 1 h)、非侵入性地定量空肠弯曲菌生物膜,检测线性范围为 1.9×10⁷至 1.5×10⁸ CFU/mL,且 NanoLuc 的高稳定性和发光效率能准确反映细胞代谢状态。尽管该方法因涉及基因修饰菌而限于实验室使用,但其为解析空肠弯曲菌生物膜动态提供了新工具,有助于间接推动食品安全措施的优化。

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