具有可控增殖和增强抗肿瘤疗效的新型HER2-CAR单核细胞疗法的开发

基本信息

英文标题：Development of a novel HER2-CAR monocyte cell therapy with controllable proliferation and enhanced anti-tumor efficacy

中文标题：具有可控增殖和增强抗肿瘤疗效的新型HER2-CAR单核细胞疗法的开发

发表期刊：《Chinese Medical Journal》

影响因子：6.1

作者单位：北京大学第五临床医学院、中国医学科学院老年医学研究所、北京大学第九临床医学院北京世纪坛医院妇产科

作者信息：Bing Yang, Xiaoxue Wang, Xundong Wei, Jie Ma.

研究背景

1. 细胞免疫疗法，特别是CAR-T细胞疗法，对血液恶性肿瘤有效，但在实体肿瘤治疗上存在挑战。

2. 实体肿瘤的复杂基质和免疫抑制环境限制了CAR-T细胞的作用，且可能引发严重毒性反应。

3. 开发新的CAR细胞策略是克服实体肿瘤治疗挑战的关键。

4. 巨噬细胞在肿瘤微环境中富集，提示它们可能有助于肿瘤治疗。

5. 自体巨噬细胞输注虽安全，但抗肿瘤效果有限。

6. 工程化单核细胞为CARs是一种有前景的治疗策略。

7. CAR-M细胞疗法的发展受限于单核细胞来源的稀缺。

8. THP1细胞系被用作开发新型CAR-M的细胞来源。

9. iCasp9自杀基因的应用有助于控制CAR-M细胞的增殖和安全性。

10. 新型CAR-M细胞有望结合天然免疫和适应性免疫，提高治疗效果。

研究方法

细胞培养：THP-1、SKOV3和NCI-N87细胞经过短串联重复(STR)验证。所有细胞系在含有5% CO2的37°C湿润环境中培养。

iCasp9-THP1细胞构建：使用商业化的pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro质粒，通过插入iCasp9-furin P2A-GFP或iCasp9-furin P2A-luciferase构建细胞。使用第三代慢病毒包装向量在HEK-293FT细胞中包装慢病毒，感染THP1细胞，并通过流式细胞术评估iCasp9表达效率。

HER2-CAR细胞构建：HER2-CAR主骨架遵循第一代经典结构，包含1× FLAG、抗体Fab段、CD8α铰链和跨膜区、CD3ζ细胞内段、CD147细胞内段和/或4-1 BB细胞内段。在HEK-293FT细胞中产生表达HER2-CAR的慢病毒，感染THP1细胞，并通过流式细胞术评估HER2-CAR表达效率。

细胞活力测定：细胞与不同浓度的AP1903处理，通过凋亡试剂盒染色后，使用流式细胞术评估细胞活力。

特异性吞噬测定：THP1细胞与SKOV3细胞共培养，通过流式细胞术评估THP1对SKOV3的特异性吞噬率。

乳酸脱氢酶(LDH)释放基于细胞毒性测定：THP1细胞与SKOV3细胞共培养后，收集细胞上清液，使用LDH检测试剂盒评估细胞损伤。

人MMP-13酶联免疫吸附测定(ELISA)：THP1细胞培养在含有HER2蛋白的低血清培养基中，收集细胞上清液，使用MMP13-ELISA试剂盒检测MMP13分泌水平。

转录组测序：从CAR-THP1或Con-THP1细胞中提取总RNA，进行质量评估和量化，然后构建测序库并进行测序。

小鼠模型：使用免疫缺陷的BALB/c-nude小鼠和NOD.CB17-Prkdcscid Il2rgtm1/Bcgen小鼠建立小鼠模型。

多重免疫荧光染色：使用多重免疫荧光染色试剂盒对样本进行染色，通过荧光显微镜观察。

统计分析：使用GraphPad Prism 8.0或R软件进行统计分析，结果以平均值±标准偏差(SD)表示，使用双尾Student's t检验(两组，假设方差齐性)进行检验。所有图表使用GraphPad Prism 8.0和R绘制。P<0.05被认为具有统计学意义。

实验结果

图1：重组HER2-CAR THP1细胞的构建和筛选

- (A)展示了CAR-THP1构建的流程图。

- (B)通过流式细胞仪检测不同CAR组合的FLAG标签表达效率。

- (C)描述了特异性吞噬作用实验的方案。

- (D,E)展示了Con-THP1和CARs-THP1对SKOV3细胞的特定吞噬作用。

- (F)通过LDH释放实验评估Con-THP1或CAR-THP1对SKOV3细胞的杀伤能力。

- (G,H)分析了Con-THP1和CAR-THP1之间的非特异性吞噬能力。

- (I–L)通过Ki-67染色和EdU掺入实验分析了Con-THP1和CAR-THP1的增殖能力。

图2：CAR-THP1在体外的功能验证

- (A,B)通过流式细胞仪检测Con-THP1和CAR-THP1对HER2蛋白的特异性结合率。

- (C)展示了CAR和FLAG-CAR蛋白质的空间结构合并图。

- (D)展示了CAR和FLAG-CAR与HER2-细胞外蛋白的分子对接结果。

- (E,F)通过分子动力学模拟展示了CAR和FLAG-CAR与HER2-细胞外蛋白的结合情况。

- (G,H)通过流式细胞仪检测CAR-HEK293FT和FLAG-CAR-HEK293FT对HER2蛋白的特异性结合率。

- (I)通过ELISAs检测MMP13的分泌水平。

- (J,K)使用Transwell板 coated with matrix 分析侵袭能力。

- (L)通过共培养跟踪SKOV3细胞生长评估抗肿瘤效率。

图3：CAR-THP1细胞在体内的抗肿瘤效果

- (A)描述了裸鼠皮下SKOV3卵巢癌异种移植模型的治疗方案。

- (B)展示SKOV3肿瘤生长曲线。

- (C–E)展示了裸鼠皮下SKOV3肿瘤组织在最后一天的照片及其重量和体积统计图表。

- (F)通过TUNEL染色评估肿瘤细胞凋亡。

- (G)通过H&E染色评估肿瘤组织结构。

- (H)通过多重免疫荧光染色评估肿瘤组织中的免疫细胞浸润情况。

- (I)描述了裸鼠皮下MDA-MB-453乳腺癌异种移植模型的治疗方案。

- (J)展示MDA-MB-453肿瘤生长曲线。

- (K–M)展示了裸鼠皮下MDA-MB-453肿瘤组织在最后一天的照片及其重量和体积统计图表。

- (N)通过TUNEL染色评估肿瘤细胞凋亡。

- (O)描述了裸鼠皮下NCI-N87胃癌异种移植模型的治疗方案。

- (P)展示NCI-N87肿瘤生长曲线。

- (Q–S)展示了裸鼠皮下NCI-N87肿瘤组织在最后一天的照片及其重量和体积统计图表。

- (T)通过TUNEL染色评估肿瘤细胞凋亡。

图4：CAR-THP1激活后的转录组变化

- (A)展示了CAR-THP1/Con-THP1比较的DEGs火山图。

- (B)展示了CAR-THP1/Con-THP1比较的DEGs热图。

- (C)展示了CAR-THP1和Con-THP1间基因表达差异的PCA图。

- (D)展示了M1和M2相关基因表达的条形图。

- (E)通过qPCR验证了Con-THP1和CAR-THP1共培养后SKOV3细胞上M1和M2标记物的表达水平。

- (F)展示了GO功能注释分析中1465个上调DEGs的BP term富集情况。

- (G–L)展示了GSEA分析结果，主要富集于巨噬细胞/单核细胞激活和产生、NK细胞、NKT细胞、Th17细胞、补体和相关细胞因子等方面。

图5：CAR-THP1与RAK免疫疗法结合具有更好的治疗效果

- (A)描述了裸鼠皮下SKOV3卵巢癌异种移植模型的治疗方案，每组6只小鼠。

- (B)展示了经过初始治疗后SKOV3肿瘤的生长曲线。

- (C–E)在治疗的最后一天，展示了裸鼠皮下SKOV3肿瘤组织的照片及其重量和体积的统计图表。

- (F)通过TUNEL染色评估SKOV3肿瘤组织的细胞凋亡情况，绿色代表TUNEL阳性的凋亡细胞。

- (G)通过免疫荧光染色检测SKOV3肿瘤组织中MMP13的表达情况，绿色代表MMP13阳性的细胞。

- (H)通过免疫荧光染色检测SKOV3肿瘤组织中RAK细胞的浸润情况，绿色代表CD8阳性T细胞。

- 比例尺=100 µm。*P <0.05, †P >0.05(不显著)，‡P <0.001, §P <0.01。CAR：嵌合抗原受体;MMP：金属蛋白酶;NES：标准化富集分数;DAPI：4′,6-二氨基苯丙烷;i.v.：静脉注射;S.C.：皮下注射;TUNEL：末端脱氧核糖核苷酸转移酶dUTP切割末端标记。

研究结论

1. 本研究构建了一种能特异性消除肿瘤的CAR单核细胞(CAR-THP1)，增强了先天性和适应性抗肿瘤免疫反应。

2. 通过比较不同的CAR组合，选择了CD3ζ-CD147构型作为最优方案，它具有最佳的吞噬效率。

3. 利用永生化的人类单核细胞系THP1作为CAR-M的细胞来源，解决了自体单核细胞数量有限的挑战。

4. iCasp9自杀基因的引入，为控制CAR-THP1的潜在不规范增殖提供了可能。

5. CAR-THP1在体内外均表现出M1表型，能够帮助改造肿瘤微环境为促炎状态。

6. CAR-THP1能够独立于T细胞存在发挥抗肿瘤作用，适合免疫功能不全的患者。

7. CAR-THP1能够作为细胞治疗的先导，促进T细胞肿瘤内浸润，与其他免疫治疗协同作用。

8. 本研究为未来的通用CAR-M疗法开发提供了有价值的参考。

9. CAR-THP1的特异性杀伤机制、安全性和疗效还需进一步研究。