A20-OVA纳米颗粒在小鼠模型中抑制过敏性哮喘

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：A20-OVA Nanoparticles Inhibit Allergic Asthma in a Murine Model.

中文标题：A20-OVA纳米颗粒在小鼠模型中抑制过敏性哮喘。

发表期刊：《Inflammation》

影响因子：4.5

作者单位：

1.Department of Pediatric Otolaryngology, Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 1033 Qinghu Blvd, Shenzhen, 518101, China

2.The Research Center of Allergy & Immunology, School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen, China

作者信息：Xiang-Qian Luo,1 Jian-Wen Zhong,1 Shu-Yao Qiu,1 Min Zhi,1 Li-Qiang Yang,1 Yi-Long Zhou,1Fen-Xuan Zhou,1 Ping-Chang Yang,2 Da-Bo Liu,1 and Li-Hua Mo.

研究背景

在过敏性哮喘的发病机制中，Th2细胞的偏移扮演着关键角色，而调节性T细胞(Treg细胞)和调节性细胞因子对于维持体内平衡至关重要。本研究旨在探究聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)-卵清蛋白(OVA)+ A20(一种泛素E3连接酶)纳米疫苗对小鼠模型中过敏性哮喘的抑制效果。研究中，A20和OVA被封装进PLGA中，形成纳米疫苗(PLGA-OVA+A20)。通过开发一个以OVA为特定抗原的过敏性哮喘小鼠模型，研究测试了PLGA-OVA+A20纳米疫苗在维持气道组织免疫平衡中的作用。结果表明，PLGA-OVA+A20纳米疫苗通过抑制Th2炎症反应和促进气道组织中Treg细胞的生成，有效抑制了小鼠的哮喘反应。研究结论认为，PLGA-OVA+A20纳米疫苗显著抑制了敏感化小鼠的气道过敏反应，主要通过促进Treg细胞的生成和IL-10的产生。这些数据表明PLGA-OVA+A20在治疗过敏性哮喘方面具有潜在的转化应用价值。

研究方法

在实验中，首先制备了重组A20蛋白及其突变体，通过将A20基因构建到PAML-C5ET载体中，然后转化到大肠杆菌Top10细胞，阳性克隆的质粒经过KpnI和EcoRI消化后，目标片段被连接到PET-32a载体中，并转化到BL21中表达。接着，通过亲和色谱纯化A20蛋白，并使用离子交换柱和ToxinEraser Endotoxin Removal Kit去除内毒素。制备PLGA-OVA+A20纳米颗粒时，将OVA+A20与PLGA共溶于二氯甲烷和丙酮中，通过探针超声形成初级乳液，再加入含聚乙烯醇的水溶液中形成二级乳液，经过搅拌过夜后蒸发有机相，用蒸馏水洗涤并离心收集纳米颗粒。使用动态光散射技术测定纳米颗粒的大小。通过将冻干的纳米颗粒溶解在含1% SDS和0.05 mol/L NaOH的水相中，测定蛋白质浓度，并通过透析袋收集释放的蛋白质量。在诱导过敏性气道炎症方面，使用雌性BALB/c小鼠，通过腹腔注射OVA和氢氧化铝混合物进行致敏，然后用含有OVA、A20和OVA+A20的鼻滴处理小鼠7天，通过吸入不同浓度的甲酰胆碱测量气道阻力，并在实验结束时收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)进行分析。使用ELISA试剂盒测定培养上清和BALF中的细胞因子水平。通过流式细胞术分析脾细胞和T细胞的增殖，其中脾细胞用APC-CD4、FITC-CD25和PE-Foxp3抗体标记，而T细胞则用CFSE标记后与树突状细胞共培养。最后，通过Student’s t test和ANOVA进行数据统计分析，以p值小于0.05作为显著性标准。

实验结果

图1. 本研究涉及A20基因的克隆、表达和纯化。

首先，通过限制性酶切分析确认了重组hyastatin-pET-28a(+)质粒(含有A20 DNA)的成功构建。接着，利用原核表达系统表达A20蛋白，并通过蛋白质印迹显示A20为可溶性蛋白。具体来说，1号样本为诱导前，2号样本为诱导后，3号样本为超声破碎后的上清液，4号样本为超声破碎后的沉淀物。进一步地，通过纯化步骤得到了A20蛋白及其突变体(mA20)，并使用分子标记(MW)进行了验证。最后，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)评估了A20的生物活性，结果显示了A20的活性，数据代表了三次独立实验的平均值±标准差。

图2. 在这项研究中，我们探讨了OVA+A20对小鼠哮喘症状的影响。

每组6只哮喘模型小鼠接受了图中X轴所示的不同处理程序。研究结果包括：a) 小鼠对甲酰胆碱吸入反应的气道阻力记录;b) 支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞计数;c) BALF中的Th2细胞因子水平;d) 血清中针对OVA的特异性IgE水平;e) 代表性的肺组织病理学图像(放大200倍)。所有数据均以平均值±标准差的形式呈现。统计分析采用ANOVA加Dunnett’s检验，*p < 0.001表示与OVA组相比有显著性差异。

图3. 在本研究中，作者对OVA+A20负载的PLGA纳米粒子进行了特性分析。

首先，通过场发射扫描电子显微镜(FESEM)观察了纳米粒子的形态，得到了清晰的图像。其次，利用动态光散射光谱(DLS)技术测定了纳米粒子的尺寸分布，这是一种通过测量光强波动来确定悬浮液中小颗粒或溶液中聚合物尺寸分布的方法。最后，评估了OVA+A20负载的PLGA纳米粒子的体外累积蛋白释放效率，这涉及到将纳米粒子溶解并透析，随后通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，以了解蛋白的释放情况。这些结果为作者提供了纳米粒子的详细特性，包括形态、尺寸和蛋白释放效率。

图4. 在本研究中，作者探究了纳米疫苗在过敏性哮喘小鼠模型中的治疗效果。

小鼠接受了如图X轴所示的不同处理程序。研究结果包括：a) 通过ELISA检测的小鼠血清中针对OVA的特异性IgE水平;b) 支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞计数;c) 对甲酰胆碱吸入反应的气道阻力;d) 代表性的肺组织组织学图像(放大200倍)。柱状图的数据以平均值±标准差的形式呈现。统计分析采用ANOVA加Dunnett’s检验，*表示与未处理小鼠组(naïve mouse group)相比，p值小于0.01;#表示与OVA+A20组相比，p值小于0.05。这些数据代表了六次独立实验的结果。

图5. 在本研究中，作者评估了气道黏膜调节性T细胞(Treg)的数量及其免疫调节功能。

从正常小鼠和哮喘小鼠的气道组织中制备单个细胞，并通过流式细胞仪进行分析。a) 筛选的点图显示CD4+ T细胞;b) 筛选的点图显示Treg细胞的频率;c) 条形图显示气道组织中Treg细胞的总结数量;d) 在b面板筛选的细胞中，直方图显示IL-10+ T细胞;e) 条形图显示d面板中总结的IL-10+ Treg细胞数量。f, g) 通过流式细胞分选系统(FCSS)，从气道组织单个细胞中分离出CD4+ CD25+ CD127− Treg细胞;从哮喘小鼠脾脏中分离出CD4+ CD25−效应T细胞和树突状细胞(DCs)。效应T细胞用CFSE标记，并与Treg细胞(Treg细胞来源在每个子面板上方显示)以5×103 : 1×103的比例共培养，每孔在OVA(或BSA)和DCs存在下。三天后，通过流式细胞仪分析细胞。f) 筛选的直方图显示增殖效应细胞的频率。g) 条形图显示增殖效应细胞的频率。条形图的数据以平均值±标准差的形式呈现。统计分析采用ANOVA加Dunnett’s检验，*表示与“a”组(b和e)或“d”组(g)相比，p值小于0.01。这些数据代表了六次独立实验的结果。

研究结论

作者克隆并表达了A20蛋白，并在OVA致敏的BALB/c小鼠模型中测试了A20或OVA+A20治疗对气道炎症的影响。结果显示OVA+A20能有效抑制哮喘反应，而单独A20治疗效果有限。利用PLGA纳米颗粒作为载体，作者制备了OVA+A20纳米疫苗，这些纳米颗粒能在96小时内完全释放载荷。纳米疫苗在降低哮喘小鼠的血清特异性IgE水平、BALF中的炎症细胞数和气道阻力方面效果显著。此外，纳米疫苗还能增加气道组织中的IL-10+ Treg细胞生成，这些Treg细胞具有抑制效应T细胞增殖的能力。