胃癌治疗新靶点：Hedgehog 信号通路调控 PD-L1 表达，联合治疗显奇效

研究背景

胃癌全球发病率居高不下，东亚、东欧等地区为高发区，晚期患者 5 年生存率仅 10%-30%。现有化疗、靶向治疗效果有限，免疫检查点抑制剂(如抗 PD-1/PD-L1 抗体)虽显示潜力，但缺乏明确的疗效预测指标。Hh 信号通路在胚胎发育中起关键作用，在胃癌等多种癌症中异常激活，但其调控 PD-L1 表达及肿瘤免疫逃逸的机制尚未明确。本研究通过小鼠模型、胃癌类器官及免疫细胞共培养体系，揭示 Hh-PD-L1 轴的作用及临床转化价值。

这篇由辛辛那提大学和密歇根大学联合发表的题为Hedgehog signaling induces PD-L1 expression and tumor cell proliferation in gastric cancer的文章，证实 Hedgehog(Hh)信号通路通过诱导 PD-L1 表达抑制细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL)功能，促进胃癌增殖;Hh 抑制剂 GANT-61 可降低 PD-L1 表达，增强胃癌类器官对化疗的敏感性，为胃癌联合治疗提供新策略。

实验方法

1.模型建立：小鼠胃癌模型与类器官培养：构建三重转基因小鼠(iLgr5;GLI2A)，通过多西环素诱导 Lgr5 + 干细胞中 GLI2A(Hh 通路关键转录因子)激活，形成胃癌;从小鼠肿瘤组织及正常胃组织分离细胞，接种于基质胶(Matrigel)中，添加特定培养基生成小鼠胃癌类器官(mTGOs)和正常胃类器官(mGOs);从胃癌患者手术切除标本中获取肿瘤组织，建立人胃癌类器官(huTGOs)。

2.免疫细胞制备：树突状细胞(DC)与 CTL 分离培养：从小鼠骨髓中分离细胞，经 GM-CSF 诱导生成 DC;从小鼠脾脏中分离脾细胞，通过磁珠分选富集 CD8+ CTL，添加 IL-2、IL-7 体外培养活化。

3.类器官 - 免疫细胞共培养实验：收集 mGOs 和 mTGOs 的条件培养基(CM)，脉冲刺激 DC;将脉冲后的 DC 与 CTL 共培养 24 小时，再与 mGOs 或 mTGOs 共培养 48 小时，部分组添加 PD-L1 中和抗体，通过 TUNEL assay 检测类器官凋亡率。

4.药物敏感性检测：huTGOs 分为单独化疗组(表柔比星、奥沙利铂、5 - 氟尿嘧啶)和化疗 + GANT-61(Hh 抑制剂)联合组，通过 MTS 法检测细胞活力，流式细胞术分析细胞死亡比例，计算 IC50 值评估敏感性。

5.异种移植实验：将 huTGOs 接种于 NSG 小鼠右侧 flank，待肿瘤体积达 100mm³ 后，分为对照组(PBS)、顺铂组、GANT-61 组、顺铂 + GANT-61 联合组，治疗 30 天后检测肿瘤体积、PD-L1 表达及 Hh 通路基因(PTCH1、PTCH2、GLI1)表达。

关键结果

图 1：Hh 抑制剂 GANT-61 减少小鼠胃癌 PD-L1 表达并抑制肿瘤形成

iLgr5;GLI2A 小鼠经多西环素诱导后，胃窦部快速形成腺癌( vehicle 组)，而 GANT-61 处理组完全阻断腺癌发生;免疫荧光显示，vehicle 组肿瘤组织 PD-L1 表达显著高于对照组，且与胃癌标志物 CD44v9 共定位;GANT-61 处理后，PD-L1 mRNA 及蛋白水平显著降低，同时 Hh 通路靶基因(PTCH1、PTCH2、GLI1、HHIP)表达也显著下调(P<0.05)。

图 2：GANT-61 抑制小鼠胃癌细胞增殖并增加 CD8+ T 细胞浸润

免疫组化显示，vehicle 组小鼠肿瘤组织中增殖标志物 PCNA 阳性细胞比例显著高于对照组，GANT-61 处理后 PCNA 阳性细胞比例明显降低;qRT-PCR 及免疫组化证实，GANT-61 处理组肿瘤组织中 CD8(CTL 标志性分子)和颗粒酶 B(CTL 杀伤功能分子)表达显著升高，CD8+ T 细胞浸润增加，提示 Hh 抑制可增强抗肿瘤免疫。

图 3：GANT-61 降低小鼠胃癌类器官 PD-L1 表达并抑制增殖

与正常胃类器官(mGOs)相比，mTGOs 的 Gli2、PD-L1 表达显著升高，EdU 阳性增殖细胞比例达 43.9%(mGOs 仅 3.17%);GANT-61(5μM、10μM)处理后，mTGOs 的 PD-L1 表达(Western blot 验证)和 EdU 阳性细胞比例均显著降低(P<0.05)，且呈浓度依赖性，证实 Hh 通路直接调控胃癌类器官的 PD-L1 表达和增殖。

图 4：肿瘤抗原诱导 CTL 表达 PD-1，PD-L1 抑制可促进胃癌类器官凋亡

DC 经 mTGOs 条件培养基(mTGOsCM)脉冲后，与 CTL 共培养，流式细胞术显示 CTL 的 PD-1、IFNγ、IL-2 表达显著升高(P<0.05)，而 mGOsCM 脉冲组无明显变化;类器官 - 免疫细胞共培养中，mTGOs + 脉冲 DC+CTL 组凋亡率较低，添加 PD-L1 中和抗体后，mTGOs 凋亡率显著升高(P<0.05)，证实 PD-L1/PD-1 结合可保护胃癌细胞免受 CTL 杀伤。

图 5：人胃癌类器官中 Gli2 与 PD-L1 表达正相关

成功建立 7 例患者来源的 huTGOs，其中 huTGO2 高表达 Gli2 和 PD-L1，huTGO7 不表达 Gli2 和 PD-L1;huTGO2 的增殖能力显著高于 huTGO7(P<0.05)，且患者原发肿瘤组织中 Gli2、PD-L1 表达及增殖水平与对应的类器官一致，证实类器官可忠实反映原发肿瘤特征。

图 6-7：GANT-61 增强高表达 Gli2 的人胃癌类器官对化疗的敏感性

huTGO2(Gli2+PD-L1+)单独化疗时 IC50 值较高(表柔比星 26.9μM、奥沙利铂 14.9μM、5-FU 31.15μM)，联合 GANT-61 后 IC50 显著降低(分别降至 2.5μM、5.253μM、5.918μM)，细胞死亡比例显著升高(P<0.05);而 huTGO7(Gli2-PD-L1-)单独化疗已表现出高敏感性，联合 GANT-61 后无明显额外效果，证实 Hh 抑制仅对 Gli2 阳性胃癌有效。

图 8：GANT-61 联合顺铂在异种移植模型中显著抑制肿瘤生长

huTGO2 接种的异种移植小鼠中，对照组肿瘤体积持续增大，顺铂组或 GANT-61 组肿瘤体积显著减小，而顺铂 + GANT-61 联合组肿瘤体积最小(P<0.05);联合组肿瘤组织中 PCNA 阳性增殖细胞比例最低，PD-L1 表达及 Hh 通路基因(PTCH1、PTCH2、GLI1)表达显著下调，证实联合治疗通过抑制 Hh-PD-L1 轴发挥协同抗肿瘤作用。

全文总结

本研究通过小鼠模型、类器官及免疫细胞共培养体系，明确 Hedgehog 信号通路是胃癌 PD-L1 表达的关键调控因子：Hh 通路激活(Gli2A 过表达)可诱导 PD-L1 表达，促进肿瘤免疫逃逸和增殖;Hh 抑制剂 GANT-61 可通过下调 PD-L1 表达、增强 CD8+ T 细胞浸润，同时提高 Gli2 阳性胃癌对化疗的敏感性，联合化疗显示出显著的协同抗肿瘤效果。该研究不仅揭示了胃癌免疫逃逸的新机制，还为临床筛选 Hh-PD-L1 轴异常激活的胃癌患者提供了依据，为开发 “化疗 + Hh 抑制剂”“免疫检查点抑制剂 + Hh 抑制剂” 等联合治疗方案奠定了基础，患者来源类器官模型也为个性化治疗效果预测提供了工具。