抗 MHC-I 抗体激活 NK 细胞抗肿瘤免疫的结构机制：阻断抑制性受体的全新策略

MHC-I 分子广泛表达于脊椎动物体细胞表面，通过与 NK 细胞表面的抑制性受体(如 KIR)结合传递抑制信号，维持免疫稳态。肿瘤细胞可利用这一机制，通过表达 MHC-I 分子与 KIR 结合抑制 NK 细胞活性，实现免疫逃逸。此前已有研究表明，抗 MHC-I 抗体可通过阻断抑制性受体相互作用激活 NK 细胞，但具体结合模式、结构基础及作用机制尚未明确。B1.23.2 作为一种高交叉反应性抗人 MHC-I 抗体，可识别多种 HLA-A、-B、-C 分子，但其结合表位及如何阻断 KIR 相互作用仍不清楚，这为该研究提供了核心切入点。

研究背景

本研究原文标题为《Structural mechanism of anti-MHC-I antibody blocking of inhibitory NK cell receptors in tumor immunity》，发表于《Communications Biology》，该研究核心成果为解析了抗 MHC-I 抗体 B1.23.2 与 HLA-B*44:05 复合物的冷冻电镜(3.02 Å)和 X 射线晶体结构(3.20 Å)，发现 B1.23.2 结合 HLA 分子的 α2₁螺旋保守区域，与 NK 细胞抑制性受体 KIR 的结合位点重叠，通过空间竞争阻断 KIR-HLA 相互作用，解除 NK 细胞抑制并激活其抗肿瘤功能，在人源化小鼠模型中显著抑制胰腺肿瘤生长。

实验方法

1.重组蛋白制备与复合物组装：构建重组 B1.23.2 抗体(含 LALAPG 突变以避免 Fc 受体干扰)及 Fab 片段，通过原核表达和复性制备 HLA-B44:05/β2m / 肽段复合物，以及 19 种肽段 P8 位突变的 HLA-B44:05 变体;通过体外孵育形成 B1.23.2-HLA-B*44:05 复合物，经凝胶过滤层析纯化用于结构解析。

2.结构解析技术应用：采用冷冻电镜(cryo-EM)技术解析 B1.23.2 全长抗体及 Fab 片段与 HLA-B44:05 复合物的三维结构，分辨率分别为 3.02 Å 和 3.31 Å;通过 X 射线晶体学解析 Fab-HLA-B44:05 复合物结构(分辨率 3.20 Å)，结合分子动力学模拟分析相互作用稳定性。

3.结合亲和力与特异性检测：利用表面等离子体共振(SPR)技术测定 B1.23.2 与不同 HLA 分子、肽段突变体及 HLA-A*02:01 突变体的结合亲和力(KD 值);通过流式细胞术和 Luminex 平台验证 B1.23.2 对 HLA-A、-B、-C 亚型的交叉反应性。

4.细胞功能验证：将 B1.23.2 与健康人外周血 PBMC 共培养，通过流式细胞术检测 NK 细胞的增殖标志物(Ki67)、活化信号(p-mTOR、pS6)、细胞因子(IFNγ)分泌及单核细胞 IL-15Rα 表达;采用 CFSE/7AAD 染色评估 NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

5.动物模型验证：构建 NSG-IL15 人源化小鼠模型，皮下接种人胰腺癌细胞 KLM1，过继转移人 CD3⁻ PBMC，腹腔注射 B1.23.2 抗体，监测肿瘤生长及小鼠生存期;流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中 NK 细胞活化标志物(NKp46、NKG2D)表达。

关键结果

图 1：B1.23.2 与 HLA-B*44:05 的结合特性与复合物结构

SPR 结果显示，B1.23.2 与 HLA-B44:05 的结合亲和力 KD=0.02 μM，显著高于 KIR 与 HLA 的结合亲和力(9.5-17 μM);B1.23.2 可识别绝大多数 HLA-A、-B、-C 亚型，但不结合 HLA-A02:01 等少数亚型。冷冻电镜分析显示，B1.23.2 Fab 片段与 HLA-B*44:05 形成稳定复合物，结构覆盖 HLA 的 α1、α2、α3 及 β2m 结构域，通过优化数据处理策略，最终获得 3.02 Å 分辨率的全长抗体复合物结构，清晰展示了 Fab 与 HLA 的相互作用界面。

图 2：B1.23.2 与 HLA-B*44:05 的相互作用细节

结构分析表明，B1.23.2 的重链(VH)和轻链(VL)CDR 环共同识别 HLA-B*44:05 的 α2₁螺旋(残基 Q141-Q155)，形成 899 Ų 的埋藏表面积(BSA)，无 β2m 参与相互作用。关键作用残基包括 HLA 的 K146(与 VL 的 4 个残基形成多重相互作用)、Q141、E148 等，以及 B1.23.2 VH 的 Y28、W29 和 VL 的 Y27、Y44 等酪氨酸 / 色氨酸残基，这些残基通过氢键和疏水作用稳定结合。此外，B1.23.2 的 L 链 Y32 与 HLA 结合肽的 P8 位形成氢键，揭示肽段对结合的轻微调控作用。

图 3：肽段 P8 位变体及 HLA 突变对结合的影响

HLA-B44:05 结合肽的 P8 位残基变异显著影响 B1.23.2 的结合亲和力：碱性残基(K、R、H)或苏氨酸(T)替代时结合最强(KD≈8 nM)，酸性残基(E、D、C)替代时结合最弱(KD≈90 nM)，分子动力学模拟显示这与 VL 的 N30 残基形成的氢键长度相关。针对 HLA-A02:01 的突变实验表明，将其 α2₁螺旋的 T142、K144、H145、H151 突变为 HLA-B44:05 的对应残基后，HLA-A02:01 获得 B1.23.2 结合能力，其中四突变体结合亲和力(KD=0.007 μM)优于野生型 HLA-B*44:05，证实 α2₁螺旋是 B1.23.2 的核心表位。

图 4：B1.23.2 与 KIR 在 HLA 上的结合位点重叠

结构叠加分析显示，B1.23.2 的 VL 结构域与 KIR2DL2 的 D2 结构域、KIR3DL1 的 D2 结构域在 HLA 表面形成空间冲突。B1.23.2 与 KIR2DL2、KIR3DL1 在 HLA 上的结合足迹高度重叠，共同识别 α2₁螺旋的 R145、K146、A149、A150、R151 残基。由于 B1.23.2 与 HLA 的结合亲和力显著高于 KIR，可通过空间竞争高效阻断 KIR-HLA 相互作用，解除 NK 细胞的抑制信号，而不影响 TCR 与 MHC-I 的结合，形成 “抗体结合→阻断 KIR→NK 细胞激活” 的分子机制。

图 5：B1.23.2 激活 NK 细胞并抑制肿瘤生长

体外实验显示，B1.23.2 处理可使 PBMC 中 CD16⁺CD56dim NK 细胞的 Ki67⁺比例从 26.7% 升至 70.9%，p-mTOR、pS6 表达及 IFNγ 分泌显著升高，单核细胞 IL-15Rα 表达上调。人源化小鼠模型中，B1.23.2 处理组的 KLM1 肿瘤体积显著小于对照组，肿瘤浸润 NK 细胞的 NKp46 和 NKG2D 表达升高，证实 B1.23.2 通过激活 NK 细胞发挥抗肿瘤作用。

全文总结

本研究通过冷冻电镜、X 射线晶体学等结构生物学技术，首次解析了抗 MHC-I 抗体 B1.23.2 与 HLA-B*44:05 复合物的高分辨率结构，明确 B1.23.2 通过重链和轻链 CDR 环结合 HLA 分子的 α2₁螺旋保守区域，与 NK 细胞抑制性受体 KIR 的结合位点高度重叠，通过空间竞争和更高的结合亲和力阻断 KIR-HLA 相互作用，解除 NK 细胞的抑制信号。功能实验证实，B1.23.2 可显著促进 NK 细胞增殖、活化及细胞因子分泌，在人源化小鼠模型中有效抑制胰腺肿瘤生长。该研究不仅阐明了抗 MHC-I 抗体激活 NK 细胞的结构基础，还揭示了 “靶向 MHC-I 阻断抑制性受体” 的全新免疫治疗策略，与传统靶向 PD-1/PD-L1 的 T 细胞导向疗法形成互补，为开发 NK 细胞激活型抗体药物提供了重要理论依据和结构模板，尤其对 MHC-I 阳性肿瘤的免疫治疗具有重要应用价值。