iPSC 衍生血管化肝脏类器官建模 ATG 诱导微血管病变及机制研究

ATG 是器官移植中常用的免疫抑制剂，但易引发肝微血管损伤、血栓形成等副作用，且缺乏能复刻人类肝脏血管特征的体外模型。iPSC 衍生的 LSECs(iLSECs)可模拟体内肝窦功能，而血管化肝脏类器官能整合血流、免疫细胞等生理微环境，为解析 ATG 的血管损伤机制及开发干预策略提供了理想工具。

来自日本东京理科大学的团队于《Cell Reports Medicine》发表了题为Modeling antithymocyte globulin-induced microvasculopathy using human iPSC-derived vascularized liver organoids的研究，构建人类诱导多能干细胞(iPSC)衍生的血管化肝脏类器官(HLBOs)模型，成功模拟抗胸腺细胞球蛋白(ATG)诱导的肝脏微血管病变;揭示 ATG 的双相损伤机制 —— 早期通过补体激活诱导肝窦内皮细胞(LSECs)血栓形成，晚期通过激活 TGF-β 通路引发中性粒细胞募集与脱颗粒;证实 TGF-β 抑制剂可缓解血栓和血流紊乱，为临床干预提供靶点。

实验方法

血管化肝脏类器官构建：iPSC 分化为肝内胚层、间充质细胞及 iLSECs 前体，通过倒置多层气液界面培养形成 HLBOs，移植到 NOD/SCID 小鼠颅窗，建立活体成像体系。

ATG 处理与干预：给移植小鼠静脉注射 ATG(1.5 mg/kg)，设置正常兔 IgG(rIgG)为对照;通过眼镜蛇毒因子(CVF)耗竭补体，用 TGF-β 受体抑制剂 SB431542 阻断通路，验证关键机制。

检测与分析：活体成像观察血栓形成、血流变化及免疫细胞募集;通过免疫染色、Western blot 检测补体成分(C3、C4)、血栓标志物(CD41、纤维蛋白原)及 TGF-β 通路分子;RNA-seq 分析 iLSECs 的基因表达变化;结合临床病例样本验证模型相关性。

关键结果

图1 HLBOs 的血管化特征与颅窗移植模型

该图验证模型构建成功：(A)HLBOs 移植到小鼠颅窗的流程及血管化过程;(B)移植后 46 天，HLBOs 中人类来源细胞表达 LSEC 标志物 LYVE1;(C-D)小口径血管(平均 12.4 μm)高表达 LYVE1 和 CD32B，大口径血管(平均 28.5 μm)表达较低;(E-F)血管均表达静脉标志物 COUP-TFII，证实 HLBOs 形成肝窦样微血管结构。结果表明，移植后的 HLBOs 可形成功能化人类肝窦样血管，适合活体成像观察。

图2 ATG 诱导 iLSEC 血管的血栓形成与血管损伤

该图呈现 ATG 的急性损伤效应：(A)ATG 处理后 6-24 小时，HLBOs 出现血流丢失和出血样改变，rIgG 组无异常;(B-C)活体成像显示 ATG 处理 0.5-6 小时，CD41 + 血小板在 iLSEC 血管内累积，面积显著增加;(D-E)3 小时后纤维蛋白原沉积增多，证实凝血激活;(F-H)24 小时时血流灌注面积减少 24.5%，血管外葡聚糖渗漏增加，提示血管屏障破坏。结果证实，ATG 特异性诱导人类 iLSEC 血管的急性血栓形成和晚期血管损伤。

图3 补体激活驱动 ATG 诱导的早期血栓

该图揭示补体的关键作用：(A)ATG 可结合到 HLBOs 的人类血管表面;(B-C)3 小时后 iLSEC 表面出现 C3 沉积，ATG 组 C3 信号显著高于 rIgG 组;(D-E)ATG 诱导 iLSECs 表面 C4 沉积，激活补体经典途径;(F-I)CVF 耗竭补体后，ATG 诱导的 C3 沉积和血小板累积显著减少，血管损伤缓解。结果表明，补体激活是 ATG 诱导早期血栓形成的核心驱动因素。

图4 临床病例验证 ATG 相关肝微血管损伤

该图建立模型与临床的关联：(A-C)临床肝移植患者使用 ATG 后，ALT 升高、血小板减少、胆红素及凝血标志物(FDP、PT-INR)升高;(D-E)多普勒超声和 CT 显示门静脉血流减少、肝灌注受损，恢复期恢复;(F-I)肝活检显示 3 区肝细胞坏死，C4d 沉积和 CD41 + 血小板聚集，与模型表现一致。结果证实，HLBOs 模型能复刻临床 ATG 诱导的肝窦血栓和微血管损伤特征。

图5 iLSECs 比动脉内皮细胞更易受 ATG 损伤

该图体现细胞类型特异性：(A)RNA-seq 显示 iLSECs 高表达静脉 / LSEC 标志物，iAECs(动脉内皮细胞)高表达动脉标志物;(B)HLBOs 中 iLSECs 高表达 LYVE1 和 CD32B，iAECs 表达较低;(C-E)ATG 处理后，iLSEC 血管的血流减少和血管渗漏更显著;(F-H)小口径 iLSEC 血管的血栓和渗漏比大口径血管更明显，尽管其 C3 沉积较少。结果表明，iLSECs 对 ATG 诱导的损伤更敏感，且小口径肝窦血管是主要损伤靶点。

图6 ATG 诱导 iLSECs 的延迟促炎反应与中性粒细胞脱颗粒

该图揭示晚期损伤机制：(A-B)RNA-seq 显示 ATG 处理 24 小时后，iLSECs 上调趋化因子(CXCL1、CCL2)和促血栓基因(SPP1、SERPINE1)，富集促炎通路;(C)ATG 剂量依赖性增加 CXCL1 分泌;(D-E)24 小时时 Ly6G + 中性粒细胞募集显著增多;(F-G)ATG 组中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)在血管腔内沉积，信号显著高于 rIgG 组;(H-I)临床样本中 3 区肝细胞周围 NE + 细胞增多，恢复期减少。结果表明，ATG 诱导 iLSECs 产生延迟促炎反应，募集中性粒细胞并诱导其脱颗粒，加重血管损伤。

图7 TGF-β 通路激活加剧 ATG 的促血栓效应

该图阐明 TGF-β 的作用：(A-C)ATG 处理后，iLSECs 分泌 PAI-1 和 CXCL1 增多，iAECs 无明显变化;(D-E)RNA-seq 显示 iLSECs 高表达 TGF-β 通路成分(TGFB2、TGFBR3、SMAD3)，与人类原代 LSECs 一致;(F)ATG 上调的基因富集 TGF-β 相关通路;(G-H)SB431542 抑制 TGF-β 通路后，iLSECs 的 PAI-1 和 CXCL1 分泌减少;(I-K)体内使用 SB431542 可减少 ATG 诱导的血小板累积，缓解血流灌注下降。结果证实，TGF-β 通路激活是 ATG 诱导血栓形成的重要放大器，抑制该通路可改善损伤。

全文总结

本文核心创新与价值体现在三方面：一是成功构建 iPSC 衍生的血管化肝脏类器官模型，可在活体条件下模拟 ATG 诱导的人类肝微血管病变，复刻临床病例的血栓形成、补体激活等关键特征;二是揭示 ATG 诱导微血管损伤的双相机制 —— 早期依赖补体经典途径激活引发血栓，晚期通过 TGF-β 通路驱动促炎反应和中性粒细胞脱颗粒，加剧血管损伤;三是证实 TGF-β 抑制剂可缓解 ATG 诱导的血栓和血流紊乱，为临床优化 ATG 用药方案、开发干预药物提供了潜在靶点。该模型解决了传统动物模型无法复刻人类肝窦血管特征的难题，为研究肝脏微血管疾病提供了可靠的人类化平台。