PD-1 信号调控 PLPP1 表达促进肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞铁死亡的机制与治疗意义

研究背景

肿瘤微环境(TME)会诱导 CD8⁺T 细胞代谢重编程与功能障碍，是免疫治疗耐药的关键原因之一。现有研究多聚焦于葡萄糖和氨基酸代谢异常，而磷脂代谢在 CD8⁺T 细胞抗肿瘤免疫中的作用尚未明确。PD-1/PD-L1 抑制剂虽在癌症治疗中取得突破，但部分患者响应不佳，其对 T 细胞磷脂代谢的调控机制仍不清楚。

来自郑州大学第一附属医院生物治疗中心、公共卫生学院、食管癌防治国家重点实验室的团队在《Immunity》上发表题为PD-1 signaling limits expression of phospholipid phosphatase 1 and promotes intratumoral CD8⁺ T cell ferroptosis的文章，研究揭示了 PD-1 信号通过 Akt-GATA1 通路抑制磷脂磷酸酶 1(PLPP1)表达，导致肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞磷脂合成异常，进而在肿瘤微环境不饱和脂肪酸诱导下发生铁死亡的核心机制，核心成果为 PLPP1 作为免疫治疗新靶点提供了理论依据，为改善 PD-1 抑制剂响应率提供了新策略。

实验方法

1.细胞与动物模型构建：从肺癌、食管癌等患者获取肿瘤组织和外周血，分离 CD8⁺T 细胞;构建 T 细胞特异性 Plpp1 敲除小鼠(Lckcre-Plpp1fl/fl)、OT1 转基因小鼠，建立 B16 黑色素瘤、LLC 肺癌等皮下移植瘤和肺转移模型;构建 MSLN-PLPP1 过表达 CAR-T 细胞。

2.代谢与分子表型分析：通过脂质组学检测 CD8⁺T 细胞中磷脂(PC、PE)及脂肪酸含量;qRT-PCR、流式细胞术、免疫荧光染色验证 PLPP1 及铁死亡相关分子(ROS、脂质过氧化、GPX4)的表达;Western blot 检测 PD-1 下游 Akt 磷酸化水平及 GATA1 蛋白表达。

3.功能验证实验：体外实验中，通过 PLPP1 敲降(shRNA)、过表达(OE)及 GATA1 敲降(siRNA)，结合铁死亡激动剂(RSL3、FIN56)和抑制剂(Ferrostatin-1)，验证 PLPP1 对 CD8⁺T 细胞铁死亡、增殖及细胞因子(IFN-γ、TNF-α)分泌的影响;体内通过过继性 T 细胞转移和 PD-1 抑制剂治疗，评估 PLPP1 对肿瘤生长和免疫应答的调控作用。

4.机制探究实验：采用 ChIP-qPCR 验证 GATA1 与 PLPP1 启动子的结合;通过 luciferase 报告基因实验确认 GATA1 对 PLPP1 的转录抑制;使用 Akt 抑制剂(MK-2206 2HCL)探究 PD-1-Akt-GATA1 通路的调控关系;共培养实验分析肿瘤微环境中不饱和脂肪酸对 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞铁死亡的诱导作用。

5.临床样本验证：分析食管癌、晚期肺癌患者外周血 CD8⁺T 细胞中 PLPP1 与 Ki67、细胞因子的相关性;检测 PD-1 抑制剂治疗前后患者 CD8⁺T 细胞中 PLPP1 的表达变化。

关键结果

图 1：肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞中 PLPP1 表达降低且磷脂代谢异常

该图揭示了肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞(CA-CD8)与外周血 CD8⁺T 细胞(PB-CD8)的代谢与分子差异。脂质组学分析显示，CA-CD8 细胞中甘油磷脂(尤其是 PC 和 PE)含量显著降低(图 1A-C)，而 PC 和 PE 的合成主要由 PLPP1 催化(图 1D);qRT-PCR、流式细胞术和免疫荧光染色证实，CA-CD8 细胞中 PLPP1 的 mRNA 和蛋白表达均显著低于 PB-CD8 细胞(图 1E-G);功能分析显示，PLPP1 高表达(PLPP1hi)的 CD8⁺T 细胞分泌 IFN-γ、TNF-α 的能力更强(图 1H)，且富集 NADPH 再生、ROS 代谢负调控等功能相关基因(图 1I-J)，PLPP1 表达与 T 细胞活化标志物呈正相关(图 1K)。结果表明，PLPP1 下调与肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞磷脂代谢异常及功能障碍密切相关。

图 2：PLPP1 缺陷通过铁死亡损害 CD8⁺T 细胞抗肿瘤功能

该图验证了 PLPP1 对 CD8⁺T 细胞存活和功能的影响。动物实验显示，Lckcre-Plpp1fl/fl 小鼠的肿瘤生长更快、存活时间更短，而 CD8⁺T 细胞耗竭后这种差异消失(图 2A-D);肿瘤组织中 CD8⁺T 细胞浸润比例降低，增殖能力下降，效应分子分泌减少，共抑制分子表达升高(图 2E-I);RNA-seq 分析显示，PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞中铁死亡相关基因(Cd36、Hmox1)上调，T 细胞活化相关基因(Tcf7、S1pr1)下调(图 2J-M);细胞死亡分析证实，PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞的死亡比例显著升高，且仅铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)能逆转该现象，凋亡或坏死抑制剂无作用(图 2N-O);铁死亡激动剂(RSL3、FIN56)会抑制野生型 CD8⁺T 细胞功能，而 PLPP1 过表达可抵抗铁死亡诱导的细胞死亡和功能障碍(图 2P-S)。结果表明，PLPP1 缺陷通过诱导铁死亡损害 CD8⁺T 细胞的抗肿瘤活性。

图 3：肿瘤微环境中的脂肪酸加剧 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞铁死亡

该图探究了肿瘤微环境中诱导铁死亡的关键因素。实验显示，Lckcre-Plpp1fl/fl 小鼠肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞的 ROS 水平和脂质过氧化程度显著升高，线粒体结构紊乱( cristae 断裂、面积缩小)(图 3A-E);肿瘤组织共培养会进一步促进 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞的 ROS 产生和脂质过氧化(图 3F-G);脂质分析显示，肿瘤间质液(TIF)中的游离脂肪酸(FFA)含量显著高于血清和脾脏(图 3H);体外实验证实，脂肪酸处理会浓度依赖性增加 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞的 ROS 水平和脂质过氧化，抑制其细胞因子分泌(图 3I-L)。结果表明，肿瘤微环境中积累的脂肪酸是加剧 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞铁死亡的关键诱因。

图 4：不饱和脂肪酸是诱导 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞铁死亡的核心成分

该图明确了脂肪酸的具体类型与作用机制。代谢分析显示，肿瘤组织中不饱和脂肪酸(如花生四烯酸 AA、油酸 OA)含量显著升高，饱和脂肪酸含量降低(图 4A-B);PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞在 AA 或 OA 处理后，含不饱和脂肪酸的 PC、PE 含量变化更显著(图 4C-D)，且铁死亡通路富集，T 细胞受体信号和糖酵解通路受抑(图 4E-F);功能实验显示，AA 处理会显著增加 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞的死亡比例，且 Ferrostatin-1 可逆转该效应(图 4G)，同时 ROS 和脂质过氧化水平升高(图 4H-I);PLPP1 激动剂能抑制 AA 诱导的 CD8⁺T 细胞铁死亡(图 4J-L);CAR-T 细胞实验显示，MSLN-PLPP1 CAR-T 细胞的磷脂含量更高，抗肿瘤效果更显著，效应分子分泌和增殖能力增强(图 4M-R)。结果表明，肿瘤微环境中的不饱和脂肪酸是诱导 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞铁死亡的核心成分，PLPP1 过表达可增强 T 细胞抗铁死亡能力。

图 5：PD-1 信号抑制 CD8⁺T 细胞中 PLPP1 表达并诱导铁死亡

该图揭示了 PD-1 信号对 PLPP1 的调控作用。共培养实验显示，CD8⁺T 细胞与肿瘤细胞共培养后，PLPP1 表达显著降低，而 PD-1 抑制剂(Pembrolizumab)可逆转该现象，CTLA4 抑制剂无作用(图 5A-C);PD-L1 Fc 激活 PD-1 信号后，CD8⁺T 细胞中 PLPP1 和 IFN-γ 表达降低(图 5D-E)，ROS 产生、脂质过氧化和细胞死亡比例升高，PD-1 抑制剂可缓解这些变化(图 5F-H);体内实验显示，PD-1 抑制剂治疗能抑制肿瘤生长和肺转移，增加肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞中 PLPP1 的表达，提升细胞增殖和效应功能，降低铁死亡水平(图 5I-P)。结果表明，PD-1 信号激活会抑制 CD8⁺T 细胞中 PLPP1 表达，进而诱导铁死亡。

图 6：PD-1 通过 Akt-GATA1 通路抑制 PLPP1 转录

该图阐明了 PD-1 调控 PLPP1 的分子机制。GSEA 分析显示，PLPP1hi CD8⁺T 细胞中 PI3K-Akt-mTOR 通路活性增强(图 6A);PD-L1 Fc 处理会抑制 CD8⁺T 细胞中 Akt 磷酸化，而 PD-1 抑制剂可促进肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞的 Akt 磷酸化(图 6B-C);PCR 阵列结合生物信息学分析筛选出 GATA1 为调控 PLPP1 的关键转录因子(图 6E-S6A);ChIP-qPCR 和 luciferase 实验证实，GATA1 可直接结合 PLPP1 启动子并抑制其转录(图 6F-S6C);Akt 抑制剂处理会增强 GATA1 与 PLPP1 启动子的结合，促进 GATA1 核转运，抑制 PLPP1 表达并降低 T 细胞功能(图 6G-L);GATA1 敲降会增加 PD-1⁺CD8⁺T 细胞中 PLPP1 的表达，提升 T 细胞浸润和效应功能(图 6M-P)。结果表明，PD-1 信号通过抑制 Akt 磷酸化促进 GATA1 核转运，进而转录抑制 PLPP1 表达。

图 7：PLPP1 缺陷削弱 CD8⁺T 细胞对 PD-1 抑制剂的响应

该图验证了 PLPP1 对 PD-1 抑制剂治疗效果的影响。动物实验显示，PD-1 抑制剂能显著抑制野生型 CD8⁺T 细胞过继转移小鼠的肿瘤生长，但对 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞过继转移小鼠无明显效果(图 7A-B);PD-1 抑制剂可增加野生型 CD8⁺T 细胞的肿瘤浸润比例和 IFN-γ 分泌，对 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞无作用(图 7C-D);单细胞 RNA-seq 分析显示，PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞主要富集在铁死亡相关集群，PD-1 抑制剂无法逆转其铁死亡表型(图 7E-H);临床样本分析显示，PLPP1 表达与 PD-1 抑制剂响应相关基因呈正相关，与 CD8⁺T 细胞增殖标志物 Ki67 及效应细胞因子(IFN-γ、TNF-α)呈正相关，PD-1 抑制剂治疗后患者 CD8⁺T 细胞中 PLPP1 表达升高(图 7I-O)。结果表明，PLPP1 表达是 CD8⁺T 细胞对 PD-1 抑制剂产生响应的关键前提。

全文总结

本研究揭示了 PD-1 信号调控 CD8⁺T 细胞磷脂代谢与铁死亡的全新机制：PD-1 激活通过抑制 Akt 磷酸化促进 GATA1 核转运，GATA1 结合 PLPP1 启动子抑制其转录，导致 CD8⁺T 细胞中 PC、PE 合成减少;肿瘤微环境中积累的不饱和脂肪酸进一步诱导 PLPP1 缺陷 CD8⁺T 细胞发生铁死亡，最终损害其抗肿瘤功能;PLPP1 过表达可通过抵抗铁死亡增强 CAR-T 细胞疗效，且 PLPP1 表达水平与 PD-1 抑制剂治疗响应正相关。该研究首次将 PD-1 信号、磷脂代谢与铁死亡三者关联，明确了 PLPP1 作为免疫治疗新靶点的潜力，为优化 PD-1 抑制剂治疗策略(如 PLPP1 激动剂与 PD-1 抑制剂联合使用)、开发新型 CAR-T 细胞疗法提供了重要理论依据和实验基础。