3D 悬浮培养下 Matrigel 支持肝细胞类器官扩增并诱导极化成熟

肝脏类器官是肝脏疾病建模、药物研发的关键工具，但体外培养中难以模拟体内细胞外基质(ECM)微环境，导致类器官扩增效率低、极化不完全。Matrigel 作为常用 ECM 成分，其在肝脏类器官培养中的具体作用及机制尚不明确。因此，解析 Matrigel 的功能及信号通路，对构建高性能肝脏类器官至关重要。

来自华南理工大学的团队在《Biomaterials Research》发表了题为Distinct Roles of Matrigel Enabled the Production of Expandable Hepatoblast and Polarized Hepatocyte Organoids from Human Embryonic Stem Cells under 3-Dimensional Suspension Conditions的文章，揭示 Matrigel 在 3D 悬浮培养条件下的双重作用 —— 低浓度(5% vol/vol)通过抑制 ROS-AMPK-mTOR 介导的过度自噬，维持 ROS - 自噬稳态，支持人类胚胎干细胞(hESCs)衍生 hepatoblast 类器官(HB-orgs)高效扩增;同时通过激活整合素介导的 FAK-ERK-AMPK 通路，诱导 HB-orgs 分化为极化肝细胞类器官(P-hep-orgs)，该类器官具备成熟肝细胞功能，可用于药物毒性筛选。

实验方法

类器官诱导与培养：hESCs(H9 细胞系)经定型内胚层(DE)分化为 hepatoblast 球体，在含 5% Matrigel 的扩增培养基中 3D 悬浮培养，获得可传代的 HB-orgs;HB-orgs 在含 Matrigel 的肝细胞成熟培养基中分化为 P-hep-orgs，对照组不加 Matrigel(生成非极化肝细胞球体 NP-hep-spheres)。

分子与功能检测：通过 RNA-seq、Western blot 检测信号通路分子(AMPK、FAK、ERK 等);免疫荧光验证肝细胞标志物(AFP、HNF4α、ALB 等)和极化标志物(ZO1、MDR1、NTCP);功能检测包括白蛋白分泌、尿素合成、CYP 酶活性、药物毒性筛选(7 种肝毒性药物)。

机制验证：使用整合素抑制剂(GRGDSP)、AMPK 激活剂 / 抑制剂，阻断或激活关键通路，验证 Matrigel 介导的扩增和极化机制。

关键结果

图1 有无 Matrigel 对 HB-orgs 扩增的影响

该图对比核心差异：(A)hESCs 分化为 HB-orgs 的流程;(B)形态与细胞扩增倍数：加 Matrigel(MG+)的 HB-orgs 可高效传代，细胞倍数显著高于无 Matrigel 组(MG-);(C)免疫荧光：两组均表达 HB 标志物 AFP 和 HNF4α，但 MG + 组表达更稳定;(D-E)转录组分析：MG + 组富集细胞增殖、Wnt 信号通路基因，MG - 组富集自噬、衰老相关基因;(F-G)GSEA 和热图：MG + 组 Wnt / 增殖基因上调，MG - 组自噬、ROS、SASP 相关基因上调。结果证实，Matrigel 是 HB-orgs 高效扩增的关键。

图2 HB-orgs 扩增的机制(ROS-AMPK-mTOR 通路)

该图揭示扩增机制：(A)MG - 组 ROS 水平显著升高;(B-D)MG - 组细胞活力下降、G0/G1 期阻滞、凋亡率升高;(E-F)TUNEL 和 SA-β-gal 染色：MG - 组凋亡和衰老细胞更多;(G)Lyso-Tracker 染色：MG - 组溶酶体活性增强(自噬激活);(H-I)Western blot：MG - 组 p-AMPK 升高、p-mTOR 降低，自噬标志物(LC3A/B、BECLIN1)上调，增殖标志物(c-MYC、CCND1)下调;(J)机制示意图：Matrigel 抑制 ROS-AMPK-mTOR 介导的过度自噬，维持 HB-orgs 增殖。结果表明，Matrigel 通过维持 ROS - 自噬稳态支持 HB-orgs 扩增。

图3 Matrigel 对 P-hep-orgs 极化的诱导作用

该图展示极化特征：(A)分化流程：HB-orgs 加 Matrigel 分化为 P-hep-orgs，无则为 NP-hep-spheres;(B-C)免疫荧光：P-hep-orgs 中紧密连接标志物 ZO1、极化标志物 MDR1(顶端)和 NTCP(基底侧)定位有序，NP-hep-spheres 紊乱;(D)CDFDA 染色：P-hep-orgs 形成规则胆小管结构，NP-hep-spheres 荧光分散;(E)透射电镜：P-hep-orgs 有顶端微绒毛、紧密连接和初级纤毛，NP-hep-spheres 仅见外部微绒毛。结果证实，Matrigel 是肝细胞类器官极化的必需条件。

图4 P-hep-orgs 的功能验证

该图验证功能优势：(A)形态：P-hep-orgs 呈多边形有序排列，NP-hep-spheres 结构紊乱;(B)免疫荧光：P-hep-orgs 高表达成熟肝细胞标志物 ALB、α1AT;(C-D)PAS 染色和 ICG 摄取 / 排泄：两组均具备基础功能，但 P-hep-orgs 表现更优;(E-G)关键功能：P-hep-orgs 白蛋白分泌持续 21 天、胆汁酸产量更高;(H-J)CYP 酶活性(CYP3A4/2C9/1A2)和尿素合成能力接近原代人肝细胞(PHHs)，显著优于 NP-hep-spheres。结果表明，P-hep-orgs 具备成熟肝细胞核心功能。

图5 P-hep-orgs 的药物毒性筛选能力

该图评估应用价值：(A)剂量 - 毒性曲线：7 种肝毒性药物对 P-hep-orgs、NP-hep-spheres、HepG2-3D 的毒性差异;(B)TC₅₀值：P-hep-orgs 对药物敏感性最高，HepG2-3D 敏感性最低;(C)安全边际(MOS)：P-hep-orgs 的 MOS 值(2-20)更接近临床实际，HepG2-3D 显著偏高;(D-E)CDFDA 染色：肝毒性药物处理后，P-hep-orgs 的胆小管荧光强度显著降低，证实 cholestasis 损伤。结果表明，P-hep-orgs 是更可靠的药物肝毒性筛选模型。

图6 P-hep-orgs 与 NP-hep-spheres 的转录组差异

该图解析分子特征：(A)PCA 分析：P-hep-orgs 聚类更接近 PHHs，NP-hep-spheres 接近 HB-orgs;(B)火山图：P-hep-orgs 有 2839 个上调基因、1681 个下调基因;(C)热图：P-hep-orgs 高表达胆汁酸代谢、尿素合成、CYP 酶相关基因;(D)GO/KEGG 分析：P-hep-orgs 富集代谢通路(药物代谢、胆汁分泌)，NP-hep-orgs 富集 ECM 组织、细胞周期通路。结果从转录组层面证实 P-hep-orgs 的成熟表型。

图7 P-hep-orgs 极化的机制(FAK-ERK-AMPK 通路)

该图揭示极化机制：(A)实验设计：GRGDSP 阻断整合素信号;(B-C)形态和免疫荧光：GRGDSP 处理后，P-hep-orgs 失去极化形态，ZO1 和 ALB 表达降低;(D-E)Western blot：GRGDSP 处理下调极化标志物(BSEP、STX3、RAB8)和通路分子(p-FAK、p-ERK、p-AMPK);(F)AMPK 激活剂可部分恢复极化标志物表达;(G)机制示意图：Matrigel 通过整合素 - FAK-ERK-AMPK 通路诱导肝细胞极化。结果证实该通路是 Matrigel 介导极化的核心。

全文总结

本文首次明确 Matrigel 在肝脏类器官培养中的双重关键作用 —— 低浓度支持 HB-orgs 扩增(抑制过度自噬)、诱导 P-hep-orgs 极化(激活整合素通路)，且阐明了对应的分子机制(ROS-AMPK-mTOR 和 FAK-ERK-AMPK 通路)。

构建的 P-hep-orgs 具备与原代肝细胞接近的功能，药物毒性筛选结果更贴合临床，解决了传统肝毒性模型(如 HepG2)敏感性不足的问题;3D 悬浮培养体系可规模化生产，为肝脏疾病建模、再生医学和药物研发提供高质量工具。