低浓度 LPS 助力牙髓干细胞修复，但年龄越大效果越弱！动物实验给出实证

本期给大家推荐的是来自中国南方医科大学南方医院口腔科、南方医科大学口腔医学院、南方医科大学口腔医院牙体牙髓科以及广州市中西医结合医院口腔科的团队的文章，《Ageing affects the proliferation and mineralization of rat dental pulp stem cells under inflammatory conditions》，发表于期刊《International Endodontic Journal》，该研究通过体外细胞实验与体内动物模型，探究了年龄对脂多糖(LPS)诱导的炎症微环境中大鼠牙髓干细胞(DPSCs)增殖和矿化能力的影响，为炎症损伤修复中 DPSCs 的年龄相关差异提供了理论依据。

实验方法

1.细胞分离与培养：选取 4 周龄幼年大鼠和 6 月龄成年大鼠各 45 只，分离其切牙牙髓组织，经胶原酶消化后，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基培养，通过有限稀释法纯化得到幼年大鼠牙髓干细胞(JDPSCs)和成年大鼠牙髓干细胞(ADPSCs)。

2.细胞生物学特性检测：采用 SA-β- 半乳糖苷酶染色比较两组细胞衰老程度;通过 CCK-8 法和流式细胞术(检测细胞周期)评估不同浓度 LPS(0、0.1、1、10、100μg/mL)对细胞增殖的影响;利用茜素红染色、qRT-PCR(检测矿化相关基因)和 Western blot(检测矿化相关蛋白)分析矿化能力。

3.实验性牙髓炎模型构建：向幼年和成年大鼠切牙牙髓腔注射 0.5μg/mL LPS 构建炎症模型，对照组不做处理，48 小时后收集牙髓组织。

4.组织学与免疫组化检测：对牙髓组织进行 HE 染色观察组织形态，通过免疫组化检测炎症因子 IL-1β 和矿化标志物 OCN 的表达水平。

5.统计学分析：采用 GraphPad Prism 6.01 软件，通过非配对 Student’s t 检验比较两组数据，单因素方差分析比较多组数据，P<0.05 为差异有统计学意义。

关键结果

图 1：JDPSCs 和 ADPSCs 的培养及衰老特征

幼年大鼠牙髓组织培养 48 小时后产生的原代细胞数量显著多于成年大鼠，纯化后的 JDPSCs 和 ADPSCs 均呈现多边形形态，无明显形态差异;但 SA-β- 半乳糖苷酶染色结果显示，ADPSCs 的阳性细胞比例显著高于 JDPSCs(P<0.01)，表明成年大鼠来源的 DPSCs 衰老程度更高。

图 2：LPS 对 JDPSCs 和 ADPSCs 增殖的影响

低浓度 LPS(0.1-1μg/mL)能显著促进 JDPSCs 和 ADPSCs 的增殖(P<0.01 或 P<0.05)，且 JDPSCs 的增殖增强效应更明显;10μg/mL LPS 处理后，JDPSCs 在第 1、3 天增殖显著增强(P<0.01)，第 5、7 天则下降(P<0.05 或 P<0.01)，而 ADPSCs 在第 3、5、7 天仍保持增殖促进效应;100μg/mL LPS 初期(第 1 天)促进增殖，后期(第 5、7 天)则抑制增殖。流式细胞术显示，10μg/mL LPS 处理 24 小时后，JDPSCs 的 S 期细胞比例显著增加(P<0.01)，ADPSCs 的 S 期细胞比例变化不明显。

图 3：不同浓度 LPS 对矿化结节形成的影响

JDPSCs 在 0.1、0.5、1μg/mL LPS 处理后，矿化结节形成量和钙含量显著增加(P<0.01)，其中 0.5μg/mL LPS 的促进效果最佳;ADPSCs 在 0.1、0.5μg/mL LPS 处理下矿化结节略有增加，而 10μg/mL LPS 处理后矿化结节显著减少(P<0.05)。基于此结果，后续实验选择 0.5μg/mL LPS 作为最佳刺激浓度。

图 4：0.5μg/mL LPS 对矿化相关基因和蛋白的影响

qRT-PCR 结果显示，JDPSCs 和 ADPSCs 经 0.5μg/mL LPS 处理后，矿化相关基因(ALP、BSP、OCN、DSPP)的 mRNA 表达水平均显著升高(P<0.01)，且 JDPSCs 的升高幅度大于 ADPSCs;Western blot 结果显示，JDPSCs 的 ALP 和 OCN 蛋白水平显著上调(P<0.05 或 P<0.01)，而 ADPSCs 仅 ALP 蛋白表达显著增加(P<0.05)，OCN 蛋白表达无明显变化。

图 5：实验性牙髓炎模型中牙髓组织的形态及蛋白表达

HE 染色显示，成年大鼠炎症牙髓组织的血管扩张程度比幼年大鼠更严重;免疫组化结果显示，两组大鼠炎症牙髓组织的 IL-1β 表达均高于健康对照组，且成年大鼠的 IL-1β 表达水平显著更高(P<0.05);幼年大鼠炎症牙髓组织的 OCN 表达显著高于健康对照组(P<0.05)，而成年大鼠炎症牙髓组织的 OCN 表达与健康对照组无明显差异。

全文总结

该研究通过体外细胞实验和体内动物模型，系统探究了年龄对炎症微环境中大鼠牙髓干细胞(DPSCs)生物学功能的影响。结果证实，低浓度脂多糖(LPS)可有效促进幼年(JDPSCs)和成年(ADPSCs)大鼠 DPSCs 的增殖，以及矿化相关基因(ALP、BSP、OCN、DSPP)和蛋白的表达，但这种炎症介导的促进效应会随年龄增长而逐渐减弱;体内实验进一步发现，成年大鼠炎症牙髓的炎症反应(IL-1β 表达)更强烈，而矿化修复相关蛋白(OCN)表达更低，提示幼年供体的 DPSCs 在炎症损伤修复中具有更优的增殖和矿化能力，更适合作为组织损伤修复的干细胞来源，该研究为牙髓炎症损伤的再生治疗提供了重要的理论支撑。