双荧光素酶报告系统：让HBV cccDNA“无处遁形”

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：A hepatitis B virus-free cccDNA-producing stable cell for antiviral screening

中文标题：一种用于抗病毒筛选的无乙型肝炎病毒cccDNA稳定生产细胞系

发表期刊：《Antiviral Research》

影响因子：4

作者单位：

1.Institute of Infectious Diseases, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou, China

2.State Key Laboratory of Anti-Infective Drug Development, Sunshine Lake Pharma Co., Ltd, Dongguan, China

3.Scientific Research Center, Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai, China

作者信息：

第一作者(共同第一)：Chengqian Feng, Jingrong Shi, Yunfu Chen, Sisi Chen

通讯作者：Feng Li

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)的共价闭合环状DNA(cccDNA)是病毒在肝细胞核内持续存在的转录模板，是HBV难以清除的根本原因。目前缺乏直接靶向cccDNA的药物，主要障碍在于：细胞内cccDNA拷贝数极低，且与大量序列几乎相同的rcDNA难以区分，导致高通量药物筛选困难。现有cccDNA研究模型多依赖CRISPR、Cre-LoxP或感染系统，操作繁琐且不便于高通量筛选。本研究设计了一种基于功能互补的cccDNA自生成稳定细胞系，将Gaussia luciferase(Gluc)报告基因嵌入cccDNA，使其发光信号仅在cccDNA形成后表达，从而简便、定量、高通量地检测cccDNA水平;同时引入萤火虫荧光素酶(Fluc)监测细胞活性，用于抗HBV药物筛选。

研究方法

将HBV基因组功能拆分为两部分：HBV helper(提供核心蛋白、聚合酶、HBx及Zeocin抗性)和HBV pgRNA provider(含5‘和3’包装信号、Gluc报告基因、preCore/Core启动子)。共转染至HepG2和Huh7细胞，经Zeocin筛选获得单克隆细胞系(HepG2-HBV-cccDNA-Gluc)。通过PCR和测序验证cccDNA形成。再以慢病毒导入Fluc表达盒(puromycin筛选)，构建双荧光素酶报告细胞系(HepG2-HBV-cccDNA/Firefly)。检测Gluc活性反映cccDNA水平，Fluc活性反映细胞活性。用该细胞系筛选2074种药物(10 μM，6天)，初筛获得425个阳性化合物，再经Huh7-cccDNA细胞系验证、HBV RNA/DNA定量、浓度梯度实验及HepG2-NTCP感染模型验证，最终确认4个具有抗HBV cccDNA活性的化合物。

实验结果

图 1：cccDNA自生成细胞系的设计原理

将HBV基因组拆分为helper和pgRNA provider两部分，后者携带Gluc报告基因但无起始密码子。helper提供核心蛋白和聚合酶，将pgRNA逆转录为cccDNA。cccDNA形成后，preC RNA转录并利用preCore的起始密码子翻译Gluc(经信号肽分泌)。因此，Gluc活性直接反映cccDNA水平，且无病毒感染风险。

图 2：HBV cccDNA稳定细胞系的建立与验证

在HepG2中经Zeocin筛选获得55个单克隆，其中#9克隆Gluc活性最高。通过PCR扩增cccDNA特异性片段(利用质粒中引入的突变位点区分rcDNA)，Sanger测序显示克隆#5、#9、#15、#24在突变位点呈现单一峰(G)，证实cccDNA成功形成。抗病毒药物测试显示：TDF和ETV(抑制逆转录)可抑制cccDNA但出现反弹;ccc_R08(新型口服cccDNA抑制剂)和punicalagin(鞣花单宁)显著降低cccDNA活性。

图 3：双荧光素酶报告细胞系用于高通量药物筛选

构建稳定表达Fluc的HepG2-HBV-cccDNA/Firefly细胞，Fluc活性与细胞数量呈线性正相关(比CCK-8更简便)。筛选2074种药物，425个初筛阳性。在Huh7-cccDNA细胞中复筛获得4个活性化合物：3A-267、5A-243、5A-245、TK-546。浓度梯度实验证实它们剂量依赖性地抑制Gluc信号(cccDNA活性)，且不影响Fluc(细胞活性)。HBV RNA检测显示这些化合物显著降低RNA水平，但HBV DNA水平无显著变化，提示其作用在cccDNA转录水平。

图 4：活性化合物在HBV感染模型中的验证

在HepG2-NTCP HBV感染模型中，3A-267、5A-243、TK-546显著降低HBV RNA水平;3A-267组HBV DNA呈下降趋势(未达统计学显著)。除TK-546外，其余三组均显著降低HBeAg水平，而HBsAg无显著变化。证实该筛选系统能够有效识别靶向cccDNA的活性化合物。

研究结论

本研究成功构建了一种无病毒的HBV cccDNA自生成稳定细胞系(HepG2/Huh7-HBV-cccDNA-Gluc)，通过功能互补设计使Gluc报告基因仅在cccDNA形成后表达，实现了cccDNA水平的简便、定量、高通量检测。在此基础上引入Fluc监测细胞活性，构建了双荧光素酶报告细胞系，并用于2074种药物的筛选，鉴定出4个具有抑制cccDNA活性的化合物(3A-267、5A-243、5A-245、TK-546)。这些化合物在HBV感染模型中验证了抗病毒效果(降低RNA、HBeAg)。该细胞系为研究cccDNA生物学和开发靶向cccDNA的抗HBV药物提供了高效、便捷的平台。