结直肠患者来源类器官（PDOs）构建与应用：标准化实验指南

结直肠癌(CRC)模型长期依赖细胞系或小鼠模型，但前者无法复现肿瘤异质性、后者难以模拟人体肠道微环境动态，制约精准医疗研究。患者来源类器官(PDOs)可保留原发组织遗传与组织学特征，是 CRC 研究核心工具，却因现有方案操作复杂、缺乏统一标准，导致新手面临污染、活力低等问题。

美国梅奥诊所的团队在《Methods Protoc》上发表题为A Practical Guide to Developing and TroubleshootingPatient-Derived "Mini-Gut" Colorectal Organoids forClinical Research的研究，提供结直肠类器官(正常 / 息肉 / 肿瘤来源)构建的标准化实验指南，明确关键操作与质控要点，为 CRC 研究提供可复用技术方案。

实验方法

组织采集与保存：结肠镜活检或手术标本需无菌条件下立即收集，放入含青霉素 - 链霉素的冷 Advanced DMEM/F12 培养基防污染;短期保存(≤6-10h)采用 4℃冷藏(DMEM/F12 + 抗生素)，活力损失最小;长期保存(≥14h)用冷冻培养基(10% FBS+10% DMSO+50% L-WRN 条件培养基)冻存，两种方式活力差异约 20-30%，也可选用 HypoThermosol FRS 专用低温保存液提升长期保存活力。

关键试剂制备(L-WRN 条件培养基)：采用可分泌 Wnt3a、R-spondin 3、Noggin 的 L-WRN 细胞系，用含 0.5mg/mL G418 和 0.5mg/mL 潮霉素的高糖 DMEM 培养;细胞汇合后换无抗生素收集培养基(DMEM+10% FBS)，连续 4 天收集上清;上清经 2000×g 离心 5min 去碎片、0.22μm 滤膜除菌，分装后 - 80℃保存，避免反复冻融影响活性。

类器官构建核心步骤：正常组织隐窝分离需将小肠组织剪碎后用 5mM EDTA 4℃摇床孵育 60-75min，预涂 FBS 的吸管机械吹打释放隐窝，500×g 离心后用冷 Matrigel(40-50μL / 孔)重悬成 dome，37℃聚合后加 50% L-WRN 完全培养基;息肉 / 肿瘤细胞分离需将组织剪至 1-2mm 碎片，用 300U/mL 胶原酶 I 37℃消化 20-30min，FBS 终止后过滤离心，Matrigel 重悬(200-500 细胞 /dome)培养;类器官 7 天左右传代，冷 Advanced DMEM/F12 破坏 Matrigel，TrypLE Express 37℃消化 10min，加 Y-27632 提升存活，Apical-out 极性反转需培养 7-9 天后 EDTA 去 Matrigel，悬浮培养 3-4 天使 apical 面朝外。

质量控制与冻存：类器官用 4% PFA 固定 3h，0.1% Triton X-100 通透后 3% BSA 封闭过夜，加 Phalloidin、ZO-1 一抗孵育 24h，荧光二抗与 DAPI 孵育 24h，共聚焦显微镜验证极性;传代至第 2 代后，用冻存培养基(80% 完全培养基 + 10% FBS+10% DMSO)重悬类器官，-80℃保存 24h 后转移至液氮长期保存，复苏时 37℃速融，离心后 Matrigel 重悬培养。

关键结果

图1：结直肠解剖分布与样本采集策略

图中展示人结直肠解剖分段(盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠)，明确右半结肠(盲肠、升结肠及横结肠近段)与左半结肠(横结肠远段、降结肠、乙状结肠)划分;流行病学数据显示 69% CRC 发生于左半结肠 / 直肠，31% 位于右半结肠，且右半结肠肿瘤更易出现 MSI-H、CIMP-H 及 BRAF 突变，指导按解剖部位分层采集正常、息肉、肿瘤组织，确保样本代表性。

图2：正常组织隐窝分离 workflow

图中呈现隐窝分离关键步骤：组织经 EDTA 孵育(4℃，60-75min)后，预涂 FBS 的吸管机械吹打释放隐窝，显微镜下可见完整管状隐窝(红色圈出);隐窝粘连时可补加 10-20U/mL DNase I 减少聚集，优质分离可使类器官形成率达 35%。

图3：PDOs 构建时序与形态

图中记录类器官培养 2-4 天生长动态：2 天细胞聚集，3 天开始出芽，4 天形成具初步 lumen 的类器官;正常组织类器官出芽率约 35%，肿瘤组织因异质性出芽率稍低(20-30%)，传代 3 代后仍保留原发肿瘤组织学特征与遗传突变。

图4：肿瘤组织机械解离操作要点

图中展示肿瘤组织机械解离过程：用无菌剪刀 / 手术刀剪至 1-2mm 碎片(避免过度研磨致细胞裂解)，结合胶原酶 I 消化可高效释放肿瘤细胞，手术标本经该方法处理后可获得 12 + 个培养 dome，满足后续实验需求。

图5：肿瘤类器官构建完整流程

图中呈现肿瘤类器官全流程：去脂肪→机械解离→胶原酶消化→过滤→Matrigel 包埋培养，0-2 天细胞聚集，7 天形成成熟类器官(具 lumen 结构)，流程重复性达 80% 以上。

图6：类器官传代后生长动态

图中记录 TrypLE 消化传代后生长情况：1 天细胞贴壁聚集，3 天形成小类器官，7-9 天达成熟;推荐传代比例 1:2-1:4，传代时加 Y-27632 可使细胞存活率提升 40%。

图7：Apical-out 类器官构建与验证

图中展示 Apical-out 类器官构建流程：类器官经 EDTA 去 Matrigel 后悬浮培养 3-4 天实现极性反转;免疫染色显示 F-actin(绿色)分布于外侧(apical 面)，DAPI(蓝色)标记细胞核;FITC - 葡聚糖渗透实验证实完整类器官可排斥 4kDa FITC - 葡聚糖(屏障功能正常)，适用于药物通透性、病原体互作研究。

全文总结

提供结直肠类器官构建的标准化实验 protocol，核心解决三大技术痛点：明确组织短期冷藏与长期冷冻的适用场景，平衡活力与便利性;优化隐窝分离、肿瘤消化、传代等关键步骤，降低操作门槛;建立 Apical-out 极性反转方法，拓展类器官应用场景。该方案可高效构建正常 / 肿瘤 PDOs，稳定保留 CRC 异质性，为 CRC 个性化药物测试、肿瘤微环境机制解析提供可靠工具，推动 CRC 精准医疗转化。