TIM-3 靶向治疗为何效果有限？HNSCC 研究发现：NK 细胞功能调控依赖双受体通路

研究背景

TIM-3(T 细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子 3)作为关键免疫检查点受体，在多种免疫细胞表面表达，尤其在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用，是癌症免疫治疗的重要潜在靶点。然而，TIM-3 可与四种配体(半乳糖凝集素 - 9、磷脂酰丝氨酸、高迁移率族蛋白 B1、癌胚抗原细胞粘附分子 1)结合，且各配体结合 TIM-3 的不同结构域，其对特定免疫细胞亚群的差异调控机制尚未明确。

自然杀伤(NK)细胞作为先天免疫的核心力量，在肿瘤监视中至关重要，但 TIM-3 配体对 NK 细胞功能的影响仍存在争议，尤其是在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中的作用尚未阐明。现有 TIM-3 靶向治疗在临床转化中效果有限，部分原因正是缺乏对配体特异性调控机制的深入理解。

由匹兹堡大学、北卡罗来纳大学教堂山分校等机构的研究人员共同完成的文章：Differential impact of TIM-­3 ligands on NK cell function，明确了 HNSCC 患者中 TIM-3+ NK 细胞的分布与功能特征，证实半乳糖凝集素 - 9 是调控 NK 细胞功能的主要抑制配体，且通过 TIM-3 和 CD44 分别抑制 NK 细胞毒性和增殖，为优化 TIM-3 靶向免疫治疗方案提供了新依据。

实验方法

1.样本收集与细胞分离：收集未接受治疗的 HNSCC 患者的外周血和肿瘤组织，以及健康捐赠者的外周血，分离外周血淋巴细胞(PBL)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，通过阴性选择富集 NK 细胞。

2.细胞处理与体外实验：NK 细胞经 IL-2 激活后，与四种 TIM-3 配体(半乳糖凝集素 - 9、HMGB1、CEACAM1、磷脂酰丝氨酸)共培养，采用 CFSE 稀释法检测增殖能力，NK-TVA assay 检测细胞毒性，流式细胞术检测细胞因子分泌及表面分子表达。

3.分子生物学检测：通过 siRNA 敲低 TIM-3 表达，验证其在配体介导的 NK 细胞功能调控中的作用;使用抗 TIM-3 抗体(sabatolimab、F38-2E2)和抗 CD44 抗体进行阻断实验，明确信号传导途径。

4.测序与数据分析：结合单细胞 RNA 测序(scRNAseq)分析 NK 细胞转录组特征，通过数字空间分析(DSP)检测肿瘤组织中半乳糖凝集素 - 9 的空间表达;利用 TCGA 数据库进行生存分析，关联 TIM-3+ NK 细胞基因特征与患者预后。

5.统计分析：采用 GraphPad Prism 进行统计检验，配对样本用 Wilcoxon 符号秩检验，独立样本用 Mann-Whitney U 检验，多组比较用单因素或双因素方差分析，P≤0.05 为差异有统计学意义。

关键结果

图 1：HNSCC 患者 NK 细胞的分布与 TIM-3 表达特征

该图通过 scRNAseq 和流式细胞术分析健康捐赠者(HD)及 HNSCC 患者的循环 NK 细胞(cNK)和肿瘤浸润 NK 细胞(tiNK)。scRNAseq 的 UMAP 图显示，NK 细胞在 HD 外周血、患者外周血和肿瘤组织中呈不同聚类(图 1A)，流式细胞术验证了其频率分布(图 1B)。转录组差异分析表明，患者 cNK 高表达干扰素诱导基因和细胞毒性分子，而 tiNK 高表达组织驻留和激活相关基因(图 1C-D)。免疫检查点受体分析显示，TIM-3(HAVCR2)是 cNK 和 tiNK 中表达最广泛的受体，患者 cNK 中 TIM-3 + 细胞比例达 86.1%，显著高于其他检查点(图 1E-F)，证实 TIM-3 是 NK 细胞的核心免疫检查点。

图 2：HNSCC 肿瘤微环境中 NK 细胞亚群分布与 TIM-3 表达

该图基于 CD56 和 CD16 表达将 NK 细胞分为三个亚群：CD56brightCD16-、CD56dimCD16+、CD56dimCD16dim/-，并分析其在不同组织中的分布及 TIM-3 表达。结果显示，HNSCC 肿瘤组织中 CD56dimCD16dim/- 亚群占比最高(67.6%)，显著高于患者外周血(32%)(图 2A-B)。TIM-3 表达在 CD56brightCD16 - 和 CD56dimCD16 + 亚群中较高，但在肿瘤组织的 CD56dimCD16 + 亚群中显著下调(图 2C-E)，而占比最高的 CD56dimCD16dim/- 亚群 TIM-3 表达最低，这解释了 tiNK 整体 TIM-3 表达低于 cNK 的现象。

图 3：TIM-3+ NK 细胞具有更高的效应潜力

该图通过流式细胞术检测 TIM-3 + 与 TIM-3- NK 细胞亚群的激活标志物表达。结果显示，无论在循环还是肿瘤组织中，TIM-3+ NK 细胞的颗粒酶 B、穿孔素和 IFN-γ 表达均高于 TIM-3 - 细胞，表明其具有更强的效应潜力(图 3A-C)。TIM-3 + 细胞还高表达 HLA-DR 和 CD44 等激活标志物，且不同亚群的抑制性受体表达存在差异：CD56brightCD16 - 亚群中 TIM-3 + 细胞高表达 PD-1，而 CD56dimCD16 + 亚群中 TIM-3- tiNK 高表达 TIGIT 和胞内 LAG-3(图 3D-E)，提示 TIM-3+ NK 细胞的功能调控具有亚群特异性。

图 4：半乳糖凝集素 - 9 特异性抑制 NK 细胞毒性和增殖

该图通过体外实验评估四种 TIM-3 配体对 NK 细胞功能的影响。结果显示，仅半乳糖凝集素 - 9 能持续抑制 IL-2 激活的 NK 细胞对 K562 靶细胞的毒性(图 4A-B)，且显著抑制 NK 细胞增殖(图 4C-D)，但不影响 IFN-γ 和 TNF 的分泌，甚至轻度促进 IFN-γ 释放。机制分析表明，半乳糖凝集素 - 9 处理后，NK 细胞的颗粒酶 B、穿孔素和 Ki-67 表达显著降低，直接削弱其效应功能和增殖能力(图 4E)，证实半乳糖凝集素 - 9 是调控 NK 细胞功能的主要抑制配体。

图 5：TIM-3 介导半乳糖凝集素 - 9 对 NK 细胞毒性的抑制，但不影响增殖

该图通过抗体阻断和 siRNA 敲低验证 TIM-3 的作用。结果显示，抗 TIM-3 抗体 sabatolimab 能有效阻断半乳糖凝集素 - 9 介导的 NK 细胞毒性抑制，而 F38-2E2 无此效果(图 5A);siRNA 敲低 TIM-3 后，半乳糖凝集素 - 9 的毒性抑制作用完全逆转(图 5B-C)，证实 TIM-3 是半乳糖凝集素 - 9 调控 NK 细胞毒性的关键受体。然而，两种抗 TIM-3 抗体均无法阻断半乳糖凝集素 - 9 对 NK 细胞增殖的抑制(图 5D)，提示增殖抑制可能依赖其他受体。

图 6：CD44 介导半乳糖凝集素 - 9 对 NK 细胞增殖的抑制

该图聚焦 CD44 在半乳糖凝集素 - 9 调控中的作用。IL-2 激活后，NK 细胞的 CD44 和 TIM-3 表达显著上调，且两者在 cNK 和 tiNK 中高度共表达(图 6A-B)。抗 CD44 抗体处理能显著逆转半乳糖凝集素 - 9 对 NK 细胞增殖的抑制(图 6C)，而 IgG4 对照抗体无此效果，证实半乳糖凝集素 - 9 通过 CD44 信号通路抑制 NK 细胞增殖，揭示其对 NK 细胞功能的双受体调控机制。

图 7：HPV+ HNSCC 患者中 TIM-3+ NK 细胞基因特征与不良预后及高半乳糖凝集素 - 9 表达相关

该图结合 TCGA 数据库和 DSP 分析探讨临床意义。TCGA 生存分析显示，TIM-3+ tiNK 高基因特征与 HPV+ HNSCC 患者的不良预后显著相关，但与 HPV - 患者无关(图 7A)。流式细胞术证实 HPV + 与 HPV - 患者的 NK 细胞 TIM-3 表达无差异(图 7B)，而 TCGA 数据显示HPV + 肿瘤的半乳糖凝集素 - 9(LGALS9)mRNA 水平显著更高(图 7C)。DSP 分析进一步验证，HPV + 肿瘤的肿瘤床和肿瘤邻近三级淋巴结构中半乳糖凝集素 - 9 蛋白表达显著高于 HPV - 肿瘤(图 7D-E)，且半乳糖凝集素 - 9 与 CD56(NK 细胞标志物)表达正相关，提示 HPV + 患者中高表达的半乳糖凝集素 - 9 可能通过 TIM-3/CD44 通路加剧 NK 细胞功能障碍。

全文总结

本研究系统探究了 TIM-3 配体对 HNSCC 患者 NK 细胞功能的差异调控机制，发现 TIM-3 是 NK 细胞中表达最广泛的免疫检查点受体，且 TIM-3+ NK 细胞具有更强的效应潜力。在四种 TIM-3 配体中，半乳糖凝集素 - 9 是唯一能持续抑制 NK 细胞功能的配体，通过 TIM-3 介导细胞毒性抑制，通过 CD44 介导增殖抑制，形成双受体调控模式。临床关联分析表明，HPV+ HNSCC 患者肿瘤组织中半乳糖凝集素 - 9 表达显著升高，TIM-3+ tiNK 高基因特征与不良预后相关，提示半乳糖凝集素 - 9/TIM-3/CD44 通路是 HPV+ HNSCC 的关键免疫抑制机制。这些发现解释了现有 TIM-3 单靶点治疗效果有限的原因，为开发针对半乳糖凝集素 - 9 或联合 TIM-3 与 CD44 的双靶点治疗策略提供了科学依据，尤其为 HPV+ HNSCC 患者的免疫治疗开辟了新方向。