Pam3CSK4诱导人单核细胞THP-1中MMP-9的表达

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Pam3CSK4 Induces MMP-9 Expression in Human Monocytic THP-1 Cells

中文标题：Pam3CSK4诱导人单核细胞THP-1中MMP-9的表达

发表期刊：《Cellular Physiology and Biochemistry》

影响因子：2

作者单位：

1.Immunology Unit, Dasman Diabetes Institute, Kuwait

2.Animal and Zebrafish Core Facility, Dasman Diabetes Institute, Kuwait

作者信息：

第一作者：Fatema Al-Rashed, Shihab Kochumon

通讯作者：Rasheed Ahmad

研究背景

基质金属蛋白酶-9能够降解细胞外基质，其水平升高与肥胖等多种炎症性疾病的发病机制相关。Pam3CSK4是一种合成的三酰化脂肽，是Toll样受体2的强效激动剂，可激活免疫细胞并诱导细胞因子产生。然而，Pam3CSK4是否能诱导单核细胞中MMP-9的表达尚不清楚。此前研究表明，细菌成分如FSL-1、热灭活单核细胞增生李斯特菌等可通过TLR2诱导MMP-9产生，但Pam3CSK4的作用尚未明确。本研究旨在确定Pam3CSK4处理THP-1细胞后MMP-9的产生情况，并探讨其信号转导通路，为理解肥胖等炎症状态下MMP-9的调控机制提供新见解。

研究方法

本研究使用人单核细胞白血病THP-1细胞系、THP-1-XBlue™报告细胞(NF-κB/AP-1驱动SEAP表达)及MyD88缺陷的THP-1-XBlue™-defMyD细胞。细胞经200 ng/mL Pam3CSK4刺激24小时，采用qRT-PCR检测MMP-9 mRNA表达，ELISA检测分泌型MMP-9蛋白，明胶酶谱法检测MMP-9酶活性。使用抗TLR2中和抗体、内吞抑制剂(氯丙嗪抑制网格蛋白依赖性内吞、甲基-β-环糊精抑制非网格蛋白依赖性内吞)、MAPK通路抑制剂(SB203580、SP600125、PD98059、U0126)和NF-κB抑制剂(环孢素A)进行干预。Western blot检测ERK、JNK、p38、c-Jun、IKKα/β、IκB、NF-κB的磷酸化水平。通过检测SEAP活性评估NF-κB/AP-1转录活性。数据以均值±SEM表示，采用单因素方差分析或t检验，P<0.05为显著。

实验结果

图 1：Pam3CSK4诱导THP-1细胞中MMP-9的表达

图1A显示，Pam3CSK4(200 ng/mL，24 h)处理THP-1细胞后，MMP-9 mRNA水平显著升高(约4倍，P=0.0021)。图1B的ELISA结果显示，MMP-9分泌蛋白也显著增加(P=0.0021)。图1C的明胶酶谱显示，Pam3CSK4处理组出现清晰的透明条带，表明MMP-9酶活性增强。TNF-α作为阳性对照同样诱导MMP-9表达。这些结果首次证明Pam3CSK4可诱导单核细胞中MMP-9的表达和活性。

图 2：TLR2中和抗体阻断Pam3CSK4诱导的MMP-9上调

图2A显示，使用抗人TLR2中和抗体(1 μg/mL)预处理THP-1细胞30分钟，可显著抑制Pam3CSK4诱导的MMP-9 mRNA表达(P=0.0005)，而同型对照抗体无影响。图2B的ELISA显示，TLR2抗体同样显著抑制MMP-9蛋白分泌(P<0.0001)。这表明Pam3CSK4通过TLR2受体介导MMP-9的产生。

图 3：内吞抑制剂对Pam3CSK4介导的MMP-9诱导的影响

图3A显示，使用网格蛋白依赖性内吞抑制剂氯丙嗪(10 μM)预处理THP-1细胞，可显著抑制Pam3CSK4诱导的MMP-9 mRNA表达(P<0.0001);而使用甲基-β-环糊精(1 mM)抑制非网格蛋白依赖性内吞则无显著影响。图3B的ELISA结果一致，氯丙嗪显著减少MMP-9蛋白分泌(P<0.0001)。这表明TLR2-配体复合物的网格蛋白依赖性内吞参与Pam3CSK4诱导的MMP-9表达。

图 4：MyD88缺陷废除Pam3CSK4介导的MMP-9产生

图4A-B显示，在MyD88缺陷的THP-1细胞中，Pam3CSK4处理未能诱导MMP-9 mRNA和蛋白的表达，而TNF-α(阳性对照，通过MyD88非依赖通路)仍能正常诱导MMP-9。这表明Pam3CSK4诱导MMP-9依赖于MyD88衔接蛋白。

图 5：Pam3CSK4激活THP-1细胞中MAPK和NF-κB信号通路

图5A显示，Pam3CSK4处理不同时间点(0-60分钟)后，ERK1/2、JNK、p38和c-Jun的磷酸化水平显著升高，总蛋白水平无变化。图5B显示，IKKα/β、IκB和NF-κB的磷酸化也随时间增加。这表明Pam3CSK4激活了经典的MAPK和NF-κB信号级联。

图 6：MAPK和NF-κB抑制剂抑制Pam3CSK4诱导的MMP-9表达

图6A-B显示，使用JNK抑制剂(SP600125)、p38抑制剂(SB203580)、MEK/ERK抑制剂(PD98059、U0126)或NF-κB抑制剂(环孢素A)预处理，均显著抑制Pam3CSK4诱导的MMP-9 mRNA和蛋白表达(P<0.0001)。图6C显示，Pam3CSK4处理THP-1-XBlue报告细胞后，NF-κB/AP-1驱动的SEAP活性显著增强(P=0.0031)。图6D显示，在MyD88缺陷细胞中，Pam3CSK4诱导的NF-κB/AP-1活性被显著抑制(P=0.0197)。这些结果证实MMP-9的诱导依赖于MAPK和NF-κB/AP-1通路的激活，且该过程需要MyD88。

研究结论

本研究首次证明，合成的三酰化脂肽Pam3CSK4可通过TLR2/MyD88依赖的信号通路诱导人单核细胞THP-1中MMP-9的表达和活性。Pam3CSK4刺激后，TLR2的激活触发网格蛋白依赖性内吞，随后招募MyD88衔接蛋白，进而激活MAPK(ERK、JNK、p38)和NF-κB/AP-1信号通路，最终促进MMP-9的转录和分泌。使用特异性抑制剂(抗TLR2抗体、内吞抑制剂、MAPK抑制剂、NF-κB抑制剂)或MyD88缺陷细胞均能显著阻断MMP-9的产生。这些发现为理解细菌脂蛋白在炎症微环境中如何调控MMP-9提供了新的分子机制，也可能为肥胖相关炎症及组织重塑相关疾病的治疗提供潜在靶点。