小鼠结肠 CD8⁺T 细胞亚群在肠道上皮与固有层中差异化生成 IL-17 表达细胞

研究背景

结肠驻留 CD8⁺T 细胞在肠道稳态维持和 IBD 发病中发挥关键作用，而 Tc17 细胞作为分泌 IL-17 的 CD8⁺T 细胞亚群，在肠道炎症中具有促炎作用，其数量增加与克罗恩病、溃疡性结肠炎的严重程度相关。然而，现有研究尚未明确结肠不同部位(上皮内与固有层)的 CD8⁺T 细胞亚群(CD8αα⁺和 CD8αβ⁺)在 Tc17 细胞生成能力上的异质性，这限制了对肠道炎症中 Tc17 细胞来源及调控机制的深入理解。因此，系统分析各 CD8⁺T 细胞亚群的 Tc17 分化潜能及相关分子机制，对阐明 IBD 发病机制和开发靶向治疗策略具有重要意义。

《Clinical and Experimental Immunology》上这篇文章，明确了小鼠结肠上皮内(IE)和固有层(LP)的 CD8⁺T 细胞亚群(CD8αα⁺和 CD8αβ⁺)分化为 IL-17 表达细胞(Tc17 细胞)的能力存在显著差异，其中 LP CD8αβ⁺T 细胞的分化能力最强，为炎症性肠病(IBD)等结肠炎症的发病机制研究提供了新视角。

实验方法

1.实验动物准备与结肠免疫细胞分离：选用 10 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，安乐死后分离结肠组织并去除派尔集合淋巴结，通过 EDTA 处理剥离上皮层，将上皮层和固有层组织剪碎后用胶原酶 V、DNA 酶 I 消化，经 40μm 细胞筛过滤和 Percoll 梯度离心富集上皮内淋巴细胞(IEL)和固有层淋巴细胞(LPL)，去除红细胞后获得单细胞悬液。

2.流式细胞术分析：采用 LIVE/DEAD 染色区分活细胞，通过表面抗体染色鉴定 CD8⁺T 细胞亚群(CD8αα⁺和 CD8αβ⁺)，经固定、透化后进行胞内细胞因子(IL-17A、IFN-γ)、转录因子(RORγt、T-bet)及磷酸化蛋白(STAT3、ERK1/2)的染色，使用流式细胞仪分析细胞亚群比例和分子表达水平。

3.Tc17 细胞体外诱导分化：流式分选 IEL 和 LPL 中的 CD8αα⁺和 CD8αβ⁺T 细胞，在含 CD3ε 抗体、CD28 抗体、IL-2、TGF-β、IL-6 等细胞因子的培养基中培养 5 天，诱导 Tc17 分化，培养结束前用 PMA、离子霉素和布雷菲德菌素 A 刺激，检测 IL-17A、IL-22 等分子表达。

4.受体表达与 TCR 信号检测：通过流式细胞术检测 CD8⁺T 细胞亚群表面 IL-6 受体(IL-6R)、TGF-β 受体(TGF-βR1/2)、CD161、IL-23R 等 Tc17 相关受体的表达;用 CD3ε 抗体交联激活 TCR 信号，检测磷酸化 ERK1/2 和磷酸化 S6 的表达水平，评估 TCR 信号强度。

5.体内结肠炎模型构建与检测：给小鼠饮用 1% 葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液 7 天诱导结肠炎症，HE 染色验证结肠炎模型成功后，分离结肠 IEL 和 LPL，通过流式细胞术检测各 CD8⁺T 细胞亚群的 Tc17 细胞生成情况及增殖标志物 Ki67 的表达。

关键结果

图 1：正常结肠 IEL 和 LPL 中 CD8⁺T 细胞亚群的组成

流式分选显示，TcRβ⁺T 细胞在 IEL 中的占比(51.8±6.0%)显著高于 LPL(27.6±3.7%);CD8⁺T 细胞(TcRβ⁺CD4⁻CD8α⁺)在 IEL 的 TcRβ⁺T 细胞中占比(55.3±4.0%)远高于 LPL(26.7±6.3%);IEL 中 CD8αα⁺和 CD8αβ⁺T 细胞占比接近(约各 50%)，而 LPL 中 CD8αα⁺T 细胞占比(79.3±5.0%)显著高于 CD8αβ⁺T 细胞(20.7±5.0%)，明确了正常结肠中 CD8⁺T 细胞亚群的基础分布特征。

图 2：CD8⁺T 细胞亚群的细胞因子和细胞毒性介质表达

经 PMA 和离子霉素刺激后，所有 CD8⁺T 细胞亚群中 IL-17A⁺细胞比例均低于 4%，而 IFN-γ⁺细胞比例为 15%-27%;CD8αα⁺T 细胞(无论 IE 还是 LP)的颗粒酶 A 和颗粒酶 B 表达频率显著高于 CD8αβ⁺T 细胞，其中 IE CD8αα⁺T 细胞的颗粒酶 B⁺细胞比例(24.1±6.3%)最高，提示正常结肠中 CD8⁺T 细胞主要以 Tc1 细胞功能为主，CD8αα⁺亚群具有更强的细胞毒性。

图 3：CD8⁺T 细胞亚群体外诱导 Tc17 分化的潜能

诱导后，LP CD8αβ⁺T 细胞的 IL-17A⁺细胞比例(41.8±6.9%)显著高于其他亚群，其次为 LP CD8αα⁺T 细胞(22.4±2.7%)和 IE CD8αβ⁺T 细胞(20.5±3.0%)，IE CD8αα⁺T 细胞最低(12.2±1.7%);LP CD8αβ⁺T 细胞的 RORγt⁺细胞(35.1±4.2%)和磷酸化 STAT3⁺细胞(43.1±6.2%)比例也最高，而 IL-23 对 Tc17 分化无显著促进作用，仅增强 IL-22 表达，证实了各亚群 Tc17 分化潜能的固有差异。

图 4：CD8⁺T 细胞亚群的 Tc17 相关受体表达与 TCR 信号强度

LP CD8αβ⁺T 细胞的 IL-6R、gp130、TGF-βR1/2 表达水平显著高于其他亚群，CD161 和 IL-23R 在诱导后也呈最高表达;TCR 信号检测显示，CD3ε 交联后，LP CD8αβ⁺T 细胞的磷酸化 ERK1/2 和磷酸化 S6 表达水平最高，IE CD8αα⁺T 细胞最低，表明受体表达差异和 TCR 信号强度差异共同调控了各亚群的 Tc17 分化潜能。

图 5：Tc17 诱导条件下 CD8⁺T 细胞亚群对结肠上皮细胞(CECs)的影响

与 CECs 共培养后，LP CD8αβ⁺T 细胞显著上调 CECs 中 CXCL1、CCL2、CCL20 等趋化因子及 TNF、S100A8 等促炎分子和宿主防御介质的 mRNA 水平，而 IE CD8αα⁺T 细胞的上调作用最弱;各亚群对 CECs 的凋亡和坏死无显著影响，提示 Tc17 细胞主要通过调控上皮细胞的炎症因子分泌参与肠道炎症，而非直接损伤上皮细胞。

图 6：炎症结肠中 CD8⁺T 细胞亚群的 Tc17 生成能力

炎症状态下，LP CD8αβ⁺T 细胞的 IL-17A⁺细胞比例(24.6±3.6%)仍显著高于其他亚群，且 IL-17A⁺IL-22⁺双阳性细胞比例最高;LP CD8αβ⁺T 细胞的 RORγt⁺细胞(18.6±2.4%)、T-bet⁺细胞(39.7±4.2%)和 Ki67⁺增殖细胞(13.1±1.6%)比例均最高，提示炎症微环境可促进各亚群 Tc17 分化，且 LP CD8αβ⁺T 细胞在炎症中仍为 Tc17 细胞的主要来源。

全文总结

本研究系统探讨了小鼠结肠上皮内和固有层中 CD8⁺T 细胞亚群(CD8αα⁺和 CD8αβ⁺)分化为 Tc17 细胞的潜能及分子机制，发现 LP CD8αβ⁺T 细胞的 Tc17 分化能力显著强于其他亚群，这一差异与该亚群高表达 IL-6R、TGF-βR 等 Tc17 相关受体及更强的 TCR 信号密切相关;同时，LP CD8αβ⁺T 细胞对结肠上皮细胞的炎症相关分子表达具有最强的调控作用，且在 DSS 诱导的炎症结肠中仍保持 Tc17 生成的优势。这些发现揭示了结肠 CD8⁺T 细胞亚群的功能异质性，明确了 LP CD8αβ⁺T 细胞在 Tc17 介导的肠道炎症中的关键作用，不仅深化了对肠道免疫稳态及炎症发病机制的理解，也为 IBD 等炎症性肠病的靶向治疗提供了潜在靶点(如调控 LP CD8αβ⁺T 细胞的 Tc17 分化)。