癌细胞内 CD28 通过靶向 PD-L1 增强抗肿瘤免疫并克服抗 PD-1 耐药的机制研究

研究背景

免疫检查点阻断治疗在 TNBC 等恶性肿瘤中疗效有限，癌细胞内在因素介导的免疫逃逸是主要耐药机制之一。CD28 传统上被认为是 T 细胞表面的共刺激分子，通过结合 B7 配体启动 T 细胞活化信号，但癌细胞中 CD28 的存在及功能尚未明确。

来自南开大学、中国医学科学院的团队在《Cancer Cell》上发表的题为Inhibiting intracellular CD28 in cancer cells enhances antitumor immunity and overcomes antiPD-1 resistance via targeting PD-L1的文章，通过体内全基因组 CRISPR 筛选发现癌细胞 CD28 是免疫逃逸关键因子，阐明其调控 PD-L1 的分子机制，验证靶向 CD28 在体内外的抗肿瘤效果及临床相关性，为克服免疫检查点阻断(ICB)耐药提供新策略。

实验方法

1.体内 CRISPR 筛选：将含 123,666 条 sgRNA 的 mGeCKOv2 慢病毒库转染 4T1 TNBC 细胞，接种至免疫健全 BALB/c 小鼠，通过 sgRNA 测序鉴定调控肿瘤免疫逃逸的关键基因;免疫缺陷小鼠(NOD/SCID、裸鼠)验证免疫依赖性。

2.细胞模型构建：采用 CRISPR-Cas9 构建 CD28 敲除(Cd28 KO)癌细胞系(4T1、EMT6 等);构建强力霉素(DOX)诱导型 CD28 敲低(Cd28 iKD)模型;过表达 CD28 全长、胞内域或胞外域，验证功能结构域。

3.体内功能验证：向 BALB/c 小鼠乳腺脂肪垫接种癌细胞，监测肿瘤生长和小鼠存活;通过生物发光成像追踪肿瘤进展;抗体 depletionCD4⁺/CD8⁺T 细胞验证效应细胞;联合抗 PD-1 抗体评估耐药逆转效果。

4.免疫微环境分析：采用流式细胞术、质谱流式(CyTOF)、单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)分析肿瘤组织中 cDC1、CD8⁺T 细胞等免疫细胞浸润及活化状态;免疫荧光、多重免疫组化验证免疫细胞分布。

5.分子机制验证：通过 RNA 稳定性实验、RNA 免疫沉淀(RIP)、iCLIP、RNA pull-down 验证 CD28 与 Cd274 mRNA 的结合;Co-IP 联合质谱鉴定 CD28 相互作用蛋白(如 SNRPB2);救援实验验证 TLR4/PI3K/AKT/mTOR 通路参与。

6.临床样本分析：收集 411 例乳腺癌(含 185 例 TNBC)临床样本，通过免疫组化、多重免疫荧光分析癌细胞 CD28 与 PD-L1 表达、CD8⁺T 细胞浸润的相关性;生存分析验证其预后价值。

关键结果

图 1：体内 CRISPR 筛选鉴定癌细胞 CD28 为免疫逃逸关键基因

对 4T1 细胞的体内 CRISPR 筛选发现，Cd28 是排名靠前的耗竭基因(图 1C);Cd28 KO 癌细胞在免疫健全小鼠中完全消退，而在免疫缺陷小鼠中正常生长(图 1B、S1A-C);癌细胞内 CD28 主要定位于细胞质和细胞核，正常乳腺上皮细胞(MCF10A)不表达(图 1D-F);CD28 赖氨酸 50(K50)乙酰化调控其亚细胞定位(图 1I-J)。

图 2：CD28 缺失依赖 CD8⁺T 细胞抑制肿瘤生长

Cd28 KO 4T1、EMT6 细胞接种后，肿瘤生长显著受抑，小鼠长期存活(图 2B-E);免疫缺陷小鼠中 Cd28 KO 无抗肿瘤效果(图 2F-G);肿瘤消退小鼠对同源癌细胞(4T1、4T07)再挑战具有抵抗力，对异源癌细胞(CT26)无交叉保护(图 2H-J);CD8⁺T 细胞 depletion 可逆转 Cd28 KO 的抗肿瘤效应，CD4⁺T 细胞无影响(图 2K);CD28 胞内域是介导免疫逃逸的关键结构域(图 2L-O)。

图 3：CD28 缺失重塑肿瘤免疫微环境，富集 cDC1 和活化 CD8⁺T 细胞

Cd28 KO 肿瘤中 cDC1 比例及活化标志物 CD86 表达升高(图 3A-B);CD4⁺/CD8⁺T 细胞浸润增加，IFN-γ⁺CD8⁺T 细胞、穿孔素(PRF)+ 颗粒酶 B(GZMB)+CD8⁺T 细胞比例显著升高(图 3C-G);scRNA-seq 显示，Cd28 KO 肿瘤中 cDC1_Dcstamp 亚群(抗原呈递能力强)富集，CD8⁺效应记忆 T 细胞(CD8_Teff/mem)增加，耗竭 T 细胞(CD8_Tex)减少(图 3I-N)。

图 4：诱导敲低 CD28 抑制已建立肿瘤生长并克服抗 PD-1 耐药

DOX 诱导 Cd28 iKD 可显著抑制 4T1 肿瘤生长，联合抗 PD-1 抗体效果更显著，延长小鼠存活(图 4D-F);Cd28 iKD 肿瘤中 CD8⁺T 细胞、活化 CD8⁺T 细胞及 cDC1 浸润增加(图 4G-L);延迟 DOX 给药(肿瘤可触及后)仍能抑制肿瘤生长(图 4M)，验证治疗潜力。

图 5：CD28 调控癌细胞 PD-L1 表达，增强 CD8⁺T 细胞毒性

Cd28 KO 或 iKD 显著降低癌细胞 Cd274 mRNA 及 PD-L1 蛋白水平(图 5A-F);人 TNBC 细胞(MCF7、MDA-MB-231)沉默 CD28 后，PD-L1 表达降低，对活化 CD8⁺T 细胞的敏感性升高，且 PD-L1 抗体无法进一步增强杀伤效果(图 5H-J);Cd28 KO 癌细胞在 IFN-γ 刺激下 MHC I 表达变化不显著，但体内膜 MHC I 水平升高(图 S8C-H)。

图 6：CD28 通过结合 Cd274 mRNA 并招募 SNRPB2 稳定其表达

质谱分析显示 CD28 与 RNA 结合蛋白(如 SNRPB2)相互作用(图 6A-B);Cd28 KO 加速 Cd274 mRNA 降解(图 6C);iCLIP、RNA pull-down 证实 CD28 直接结合 Cd274 mRNA(图 6D-H);CD28 胞内域的 RNA 结合基序突变可阻断与 Cd274 mRNA 的结合(图 6I);SNRPB2 与 CD28 共定位，且依赖 CD28 结合 Cd274 mRNA(图 6J-L)。

图 7：临床样本中癌细胞 CD28 高表达与不良预后相关

TNBC 样本中癌细胞 CD28 表达率显著高于其他乳腺癌亚型(图 7A-B);CD28⁺癌细胞周围 CD8⁺T 细胞、GZMB⁺CD8⁺T 细胞数量更少，且 GZMB⁺CD8⁺T 细胞距离更远(图 7C-E);癌细胞 CD28 表达与 PD-L1 表达正相关(图 7F、H);CD28 高表达 TNBC 患者总生存期更短(图 7G);SNRPB2 高表达与 PD-L1 升高、CD8⁺T 细胞浸润减少相关(图 7I-J)。

全文总结

本研究首次揭示癌细胞内 CD28 的非经典功能：作为 RNA 结合蛋白，通过招募 SNRPB2 稳定 Cd274 mRNA，上调 PD-L1 表达介导免疫逃逸。靶向癌细胞 CD28 可通过富集抗原呈递能力强的 cDC1 亚群，激活肿瘤特异性 CD8⁺T 细胞，将 “冷肿瘤” 转化为 “热肿瘤”，从而抑制肿瘤生长并克服抗 PD-1 耐药。临床样本验证进一步证实 CD28-PD-L1 轴的临床相关性，为 TNBC 等免疫治疗耐药肿瘤提供了新的治疗靶点。研究打破了 CD28 仅作为 T 细胞共刺激分子的传统认知，拓展了对肿瘤免疫逃逸机制的理解，为开发靶向癌细胞内在免疫调节因子的联合治疗策略提供了实验支撑。