MiR-143-3p通过靶向BMPR2调控力学刺激下滑膜间充质干细胞的软骨分化

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：MiR-143-3p regulates chondrogenic differentiation of synovium derived mesenchymal stem cells under mechanical stress through the BMPR2-Smad signalling pathway by targeting BMPR2

中文标题：MiR-143-3p通过靶向BMPR2调控力学刺激下滑膜间充质干细胞的软骨分化—基于BMPR2-Smad信号通路

发表期刊：《Journal of Oral Rehabilitation》

影响因子：4.0

作者单位：

1.Department of Orthodontics, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao, China

2.School of Stomatology, Qingdao University, Qingdao, China

3.Department of Pathology, Qingdao Hospital, University of Health and Rehabilitation Sciences (Qingdao Municipal Hospital), Qingdao, China

4.Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration and Shandong Provincial Clinical Research Center for Oral Diseases, Jinan, China

作者信息：

第一作者(共同第一作者)：

Xiao Yan

Qiang Zhang

通讯作者：

Tao Lv

Xiao Yuan

研究背景

下颌后缩引起的骨性II类错颌畸形是正畸临床中的常见问题，功能矫治器通过力学刺激促进髁突改建，但其分子机制尚不明确。滑膜来源间充质干细胞(SMSCs)具有良好的软骨分化潜能，是颞下颌关节软骨再生的重要细胞来源。力学刺激可促进SMSCs的软骨分化，但其中的miRNA调控网络仍未阐明。本研究聚焦于miR-143-3p，通过高通量测序发现其在循环力学拉伸下的SMSCs中表达显著下调。作者推测miR-143-3p可能通过靶向骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)及其下游Smad信号通路，调控力学刺激诱导的SMSCs软骨分化，从而为颞下颌关节髁突改建提供新的分子靶点。

研究方法

作者从4周龄SD大鼠的颞下颌关节滑膜组织中分离培养SMSCs，通过流式细胞术鉴定表面标志物(CD44⁺/CD90⁺，CD8⁻/CD34⁻)，并验证其成骨、成软骨、成脂三系分化能力。采用FlexCell系统对SMSCs施加循环单轴拉伸力学刺激(幅度5%，频率0.1 Hz，每天4小时，共21天)，以静态培养为对照。通过高通量测序筛选力学敏感miRNA，并利用qRT-PCR和Western blot检测软骨分化标志基因(COL2A1、ACAN、SOX9)及BMPR2/Smad通路蛋白的表达。使用慢病毒介导miR-143-3p的过表达(mimics)或抑制(inhibitor)，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-143-3p与BMPR2 3‘UTR的直接结合。采用siRNA敲低BMPR2，观察其对软骨分化和Smad1/5/8磷酸化的影响，并通过阿利新蓝染色评估软骨基质蛋白聚糖的沉积。

实验结果

图 1：大鼠SMSCs的分离、培养与鉴定

作者从大鼠颞下颌关节滑膜组织中成功分离出原代细胞，培养第1天细胞呈小圆形，第5天细胞明显伸长并呈现定向、有序的排列方式。流式细胞术鉴定显示，该细胞高表达间充质干细胞阳性标志物CD44(99.8%)和CD90(99.8%)，而几乎不表达阴性标志物CD8(0.01%)和CD34(0.031%)，证明所获细胞为纯度较高的SMSCs。进一步分化实验表明，该细胞在成骨诱导后茜素红染色阳性(钙结节)，成软骨诱导后阿利新蓝染色阳性(蛋白聚糖)，成脂诱导后油红O染色阳性(脂滴)，证实其具有三系分化潜能。这一部分为后续力学刺激和分子调控实验奠定了可靠的细胞模型基础。

图 2：循环力学拉伸促进SMSCs的软骨分化

作者对SMSCs施加循环拉伸(5%幅度，0.1 Hz，每天4小时)，在培养第1、3、5、7天检测软骨分化相关基因的表达。qRT-PCR结果显示，拉伸组中COL2A1(图2A)和ACAN(图2B)在第3、5、7天均显著高于对照组，SOX9(图2C)在第5、7天也显著升高。Western blot(第5天)进一步证实，拉伸组的SOX9、COL2A1和ACAN蛋白水平均明显上调(图2D)。阿利新蓝染色(第7天)显示拉伸组软骨基质蛋白聚糖沉积显著增多。有趣的是，第5天时拉伸组的SMSCs出现明显的重排和定向排列，细胞长轴沿力学方向排列(图2F)，而对照组细胞呈随机分布(图2E)。这些结果首次明确表明，循环力学拉伸可直接促进SMSCs的软骨分化。

图 3：力学拉伸诱导SMSCs中差异表达miRNAs的筛选及miR-143-3p的时间变化

作者利用高通量测序比较了拉伸处理5天组与对照组的miRNA表达谱。热图显示共有133个miRNAs发生显著变化(变化倍数≥2.0)，其中70个下调(如miR-143-3p、miR-499a-5p等)，63个上调(如miR-416、miR-380等)(图3A)。值得注意的是，拉伸组中miR-143-3p的表达在第5天比对照组下降了53%(图3B)。时间进程qRT-PCR显示，在拉伸组中，miR-143-3p从第1天到第5天持续下调(超过2.6倍)，并维持低水平至第7天;而对照组中miR-143-3p的表达随时间无明显波动(图3C)。这些结果提示，miR-143-3p的下调可能是力学刺激诱导SMSCs软骨分化过程中的一个关键事件。

图 4：miR-143-3p负向调控力学拉伸诱导的SMSCs软骨分化

为了直接验证miR-143-3p的功能，作者使用慢病毒在SMSCs中分别过表达(mimics)或抑制(inhibitor)miR-143-3p，并设置相应的阴性对照。荧光显微镜下GFP表达显示感染效率达80-90%(图4A)。qRT-PCR证实mimics组miR-143-3p显著升高，inhibitor组显著降低(图4B, C)。阿利新蓝染色(第5天)显示，miR-143-3p过表达显著抑制了软骨基质蛋白聚糖的沉积，而miR-143-3p抑制则增强了沉积(图4D)。qRT-PCR和Western blot结果一致：过表达miR-143-3p后，软骨标志基因COL2A1和ACAN的mRNA(图4E)及蛋白(图4G, I)水平均显著降低;而抑制miR-143-3p后，这些标志物的表达显著升高(图4F, H, J)。综上，miR-143-3p是力学拉伸诱导SMSCs软骨分化的一个负调控因子。

图 5：miR-143-3p直接靶向BMPR2，且BMPR2介导拉伸诱导的软骨分化

生物信息学预测显示BMPR2的3‘UTR区域存在miR-143-3p的潜在结合位点(图5A)。双荧光素酶报告基因实验表明，共转染miR-143-3p mimics与野生型BMPR2 3’UTR载体后，荧光素酶活性显著降低;而突变型载体则无此效应(图5B, C)，证明miR-143-3p直接结合BMPR2。力学拉伸5天后，SMSCs中BMPR2蛋白表达较静态对照组明显升高(图5D)。在拉伸条件下，miR-143-3p抑制剂使BMPR2表达进一步升高，而miR-143-3p mimics则降低BMPR2表达(图5E)。进一步使用siRNA敲低BMPR2后发现，si-BMPR2可逆转由miR-143-3p抑制剂所诱导的BMPR2 mRNA和蛋白上调(图5F, G)，同时也可逆转抑制剂引起的COL2A1、ACAN和SOX9的上调(图5H, I)。这些结果证实，BMPR2是miR-143-3p的直接功能靶点，并且在拉伸诱导的SMSCs软骨分化中发挥关键的下游效应。

图 6：miR-143-3p通过BMPR2-Smad信号通路调控软骨分化

BMPR2的下游经典信号通路为Smad1/5/8磷酸化。为了阐明miR-143-3p的作用机制，作者检测了拉伸5天后SMSCs中总Smad1、Smad5、Smad8及其磷酸化水平。结果显示，无论过表达还是抑制miR-143-3p，总Smad蛋白水平均无显著变化;但过表达miR-143-3p显著降低了p-Smad1、p-Smad5和p-Smad8的水平，而抑制miR-143-3p则显著增加了这些磷酸化水平(图6A-D)。更重要的是，敲低BMPR2可完全抵消miR-143-3p抑制剂所诱导的p-Smad1/5/8升高(图6A-D)。基于这些发现，作者提出了一个模型(图6E)：循环力学拉伸通过下调miR-143-3p，解除其对BMPR2的抑制，BMPR2表达升高后激活Smad1/5/8磷酸化，最终促进SMSCs的软骨分化。

研究结论

本研究首次揭示了在循环力学拉伸刺激下，SMSCs中miR-143-3p表达显著下调，从而解除了对靶基因BMPR2的翻译抑制;BMPR2上调后激活其下游Smad1/5/8信号通路，最终促进SMSCs的软骨分化。通过功能获得和丧失实验、双荧光素酶报告基因、siRNA干扰等多项技术，作者系统证明了miR-143-3p-BMPR2-Smad轴是力学刺激转化为生化信号、驱动SMSCs软骨分化的核心分子机制。这一发现不仅为理解功能矫治器诱导髁突改建的机制提供了新视角，也为颞下颌关节软骨再生和骨性II类错颌畸形的生物治疗提供了潜在的新靶点(如抑制miR-143-3p或激活BMPR2)。