分子转子探针：让蛋白质“点亮自己”，实现活细胞实时监测

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Molecular rotor-based probes for protein monitoring in biomedical research

中文标题：基于分子转子探针的生物医学研究中蛋白质监测技术

发表期刊：《Nature Reviews Chemistry》

影响因子：51.7

作者单位：

1.State Key Laboratory of Geomicrobiology and Environmental Changes, Faculty of Materials Science and Chemistry, China University of Geosciences, Wuhan, China.

2.School of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Nanyang Technological University, Singapore, Singapore.

3.Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, Singapore, Singapore.

4.State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Chemical Biology Center, Department of Molecular and Cellular Pharmacology, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing, China.

作者信息：

第一作者(共同第一作者)：

Xia Wu

Yuxuan Hu

通讯作者(共同通讯)：

Kanyi Pu

Xiaoding Lou

Fan Xia

Tao Liu

研究背景

蛋白质是生命活动的基本执行者，其表达水平、空间分布、翻译后修饰及相互作用的变化与疾病发生发展密切相关。传统的蛋白质检测方法如ELISA、Western blot和质谱需要裂解细胞或固定样本，无法实现活细胞中蛋白质动态变化的实时监测。荧光成像技术能够克服这一局限，其中分子转子(molecular rotor)荧光探针因其对微环境变化的高度敏感性和可调节的光物理性质而独具优势。分子转子探针在游离状态下因分子内旋转导致荧光淬灭，当与靶蛋白结合或处于受限环境中时，旋转受限从而“点亮”荧光。本文系统综述了基于分子转子探针的设计策略、检测机制及其在疾病诊断、化学生物学研究中的应用，并讨论了当前挑战与临床转化前景。

研究方法

本文是一篇文献综述，作者系统检索和整合了近年来关于分子转子荧光探针用于蛋白质监测的研究成果。文中首先介绍了分子转子探针的基本设计策略，包括非共价结合聚集蛋白、与特定氨基酸残基形成共价键、配体介导的非共价结合、蛋白酶激活的共价键断裂等四种主要机制以及其他新兴策略。随后，作者按照应用领域分类，详细总结了分子转子探针在神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病)、癌症诊断、荧光引导手术、靶向治疗等领域的代表性研究，以及在化学生物学中监测蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA/RNA相互作用和蛋白质组学分析中的应用。最后，作者分析了当前分子转子探针面临的挑战(如特异性不足、光稳定性差、波长范围有限等)，并展望了未来的发展方向，包括引入遗传密码扩展技术、近红外/短波红外成像、多模态整合以及临床转化路径。

实验结果

图 1：分子转子探针的设计策略与信号调控机制

作者将分子转子探针的设计策略按照结合特异性和相互作用强度递增的顺序分为四大类，并辅以其他新兴策略。图1a展示了非共价结合聚集蛋白的策略：探针通过疏水相互作用和π-π堆积定位于蛋白聚集体的疏水空腔中，分子内旋转受限从而激活荧光，适用于检测淀粉样或无序蛋白聚集体。图1b为共价键形成策略：探针与目标蛋白上的特定氨基酸残基(如半胱氨酸、赖氨酸)发生共价反应，实现稳定、位点特异性的标记，适合于复杂环境中的长期追踪。图1c为配体介导的非共价结合策略：探针通过连接的小分子、多肽或蛋白质配体与目标蛋白的天然结合口袋结合，实现可逆的、结构敏感的检测。图1d为蛋白酶触发的共价键断裂策略：探针含有可被特定蛋白酶切割的识别单元，切割后释放分子转子并激活荧光，适用于检测酶活性或药物激活。图1e为其他新兴策略，如环境敏感基元或多响应探针，扩展了多参数或原位蛋白质分析的工具箱。这一分类体系有助于研究者根据目标类型、所需特异性和实验背景选择合适的探针。

图 2：分子转子探针在神经退行性疾病中监测错误折叠蛋白的应用

图2展示了四种代表性分子转子探针在神经退行性疾病研究中的应用。图2a中，Petersson团队开发了基于双曼(bismane)的分子转子探针4a(激发436 nm，发射640 nm)，通过TICT机制实现对帕金森病模型中α-突触核蛋白原纤维的敏感检测。图2b中，一种名为Tau 1的BODIPY探针(激发590 nm，发射670 nm)能够选择性结合tau蛋白缠结而非β-淀粉样斑块，分子对接揭示了其与PHF6原纤维表面的特异性相互作用，且Tau 1能有效穿透血脑屏障并在转基因小鼠中实现体内成像。图2c中，Hong团队开发的TPE-MI探针(激发350 nm，发射470 nm)通过共价标记未折叠蛋白上暴露的半胱氨酸巯基，在亨廷顿病模型中发现荧光增强先于聚集体形成，揭示了可溶性错误折叠物种早期破坏蛋白质稳态。图2d中，基于分子转子的非天然氨基酸AnapTh被掺入与ALS相关的hSOD1-A4V蛋白中，能够在残基水平实时监测蛋白构象变化、聚集和解离，揭示了聚集过程中局部粘度和疏水性增加的关键病理标志。

图 3：分子转子探针在癌症诊断中的蛋白监测应用

图3汇总了四种用于癌症相关蛋白检测的分子转子探针。图3a中，基于N,N-二甲基萘胺衍生物的双光子探针CD1(激发430 nm，发射600 nm)靶向胶质瘤中过表达的MAO A，通过计算筛选获得高亲和力和选择性，能够实时成像并定量区分胶质瘤与相邻正常组织的MAO A表达水平。图3b中，多肽探针L2P4(激发470 nm，发射630 nm)识别EBNA1病毒癌蛋白，结合后荧光增强，实现了肿瘤细胞中EBNA1的特异性核成像和体内肿瘤实时可视化。图3c中，DCM-IN-NH2探针(激发500 nm，发射710 nm)采用“荧光极性翻转”策略，原本因自由旋转不发光，被NAT2乙酰化后引入吸电子基团使分子刚性化，恢复荧光，用于肝癌中NAT2活性检测。图3d中，CyNAP-SS-FK是一个双锁设计的近红外探针(激发550 nm，发射680 nm)，同时响应谷胱甘肽和组织蛋白酶B，切割后发生分子内点击环化，不仅点亮荧光还可诱导自组装，在小鼠中成功检测到小至2 mm的肝癌病灶，信噪比约5，检测窗口长达36小时。

图 4：分子转子探针在荧光引导手术和精准治疗中的应用

图4展示了四种用于手术导航和治疗的分子转子探针。图4a中，ODAP-490探针(激发490 nm，发射660 nm)靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)，结合后旋转受限触发快速荧光增强，在患者来源组织和动物异种移植模型中实现实时肿瘤分期和切缘识别。图4b中，MAT探针(激发410 nm，发射550 nm)首先结合内质网上的SUR1，然后与未折叠蛋白反应形成三明治复合物，消除光诱导电子转移并产生强荧光，实现跨多种癌症类型的高对比成像，用于精准手术导航。图4c中，ESR探针(激发490 nm，发射660 nm)是一种环境敏感报告分子，其荧光强度与PROTAC介导的蛋白降解程度成正比，能够无创监测靶点参与度和治疗疗效。图4d中，HEDP探针(激发500 nm，发射720 nm)与人血清白蛋白结合后形成稳定复合物，不仅化学发光增强>10倍，还将光动力机制从II型(单线态氧)转换为更高效的I型(超氧阴离子和羟基自由基)，集成了增强的成像指导和更有效的治疗机制。

图 5：分子转子探针用于监测蛋白质-蛋白质相互作用

图5展示了四种监测蛋白质-蛋白质相互作用的分子转子策略。图5a中，通过遗传密码扩展技术将分子转子型非天然氨基酸(如PAPd)位点特异性地掺入FKBP蛋白中，当FKBP与FRB在雷帕霉素诱导下相互作用时，转子位于蛋白界面，旋转受限从而激活荧光，实现了无洗涤、实时监测蛋白相互作用。图5b中，另一分子转子非天然氨基酸AnapTh(激发420 nm，发射630 nm)被掺入CRY2簇中，能够敏感检测光诱导的聚集和随后的解离，为研究光遗传系统提供了高空间分辨率工具。图5c中，基于荧光寿命成像的多重系统(tr-Fucsi)利用不同突变赋予的荧光寿命差异(1-5 ns)，同时追踪细胞周期中CDK2和CDK4/6的活性及hGem/hCdt1融合蛋白的降解与合成。图5d中，Baker团队通过计算机辅助从头设计合成β-桶蛋白(mFAP)，其空腔精确塑造以结合并刚化DFHBI分子，激活荧光80倍，实现了线粒体和内质网等细胞器的特异性成像。

图 6：分子转子探针用于监测蛋白质-DNA/RNA相互作用

图6展示了四种分子转子探针在核酸-蛋白相互作用研究中的应用。图6a中，CCVJ1探针(激发470 nm，发射510 nm)通过快速肟化学反应检测DNA糖基化酶切除损伤碱基后产生的基本位点，结合后荧光显著增强，可在活细胞和裂解液中实时监测糖基化酶活性。图6b中，TPE-Py探针(激发405 nm，发射575 nm)是一种阳离子分子转子，端粒酶延伸引物产生重复序列后，其带负电的DNA通过静电作用和嵌入作用聚集TPE-Py，限制旋转并点亮荧光，用于癌细胞中端粒酶活性的成像和药物反应跟踪。图6c中，NBSI染料(激发524 nm，发射580 nm)被RNA适配体Clivias结合后刚化并发出明亮的荧光，与NanoLuc荧光素酶组成BRET对，实现了生理条件下RNA-蛋白相互作用的实时监测。图6d中，PA-Broccoli是一种可光激活的RNA标签(激发470 nm，发射505 nm)，初始无荧光，紫外照射后荧光增强6000倍，速度比PA-GFP快1-2个数量级，成功绘制了活细胞中关键蛋白-RNA相互作用图，揭示了细胞质RNA比蛋白质迁移受限，以及环状RNA以Ran-GTP依赖性方式出核且胞浆积累速度慢于线性mRNA。

图 7：分子转子探针在蛋白质组学中识别新蛋白靶点

图7展示了四种基于分子转子探针的化学蛋白质组学策略。图7a中，AggLink 1.0探针融合了分子转子(荧光报告聚集)和TCO标签(耐离液盐富集)，在应激细胞中捕获并富集了HSP90抑制或蛋白酶体抑制诱导的非晶态聚集蛋白，揭示了异质性聚集途径并发现了协同降低癌细胞活力的潜在靶点。图7b中，TME探针通过两步荧光激活：首先与柔性蛋白区域表面暴露的半胱氨酸反应消除PET淬灭，然后与未折叠蛋白结合进一步限制旋转，最终点亮荧光，并在帕金森病患者细胞中鉴定了内源性无序蛋白的全局图谱。图7c中，LDPL探针(激发500 nm，发射630 nm)是一种微小的NBD转子，具有溶致变色性，可定位于脂滴内，通过光交联基团和炔烃手柄共价标记并富集脂滴相关蛋白，鉴定出1584个高置信度脂滴蛋白，发现CHMP6为脂噬受体、PRDX4为脂肪分解抑制因子。图7d中，AlZn-2探针利用Zn²⁺依赖的反应性：Zn²⁺结合增强酰基咪唑的亲电性，实现Zn²⁺富集环境中蛋白质的选择性标记，成功鉴定了氧化应激下胶质瘤细胞中锌相关蛋白质组的动态变化。

研究结论

本综述系统阐述了分子转子荧光探针在蛋白质监测中的设计原理、响应机制及广泛的生物医学应用。分子转子探针通过将分子内旋转受限转化为荧光信号，实现了活细胞和活体中蛋白质动态、构象变化及微环境的无创、实时可视化。文中详细总结了针对聚集蛋白、特定氨基酸残基、配体结合口袋和蛋白酶活性等不同靶点的设计策略，并展示了其在神经退行性疾病标志物检测、癌症早期诊断、荧光引导手术、PROTAC药物疗效监测、蛋白质-蛋白质/蛋白质-核酸相互作用研究以及化学蛋白质组学(如聚集蛋白组、无序蛋白组、脂滴蛋白组、锌相关蛋白组)中的强大应用能力。尽管当前仍面临特异性、光稳定性、近红外波长扩展和体内稳定性等挑战，但随着遗传密码扩展、计算机辅助蛋白设计、多模态成像及生物电子学平台的整合，分子转子探针有望从基础研究工具发展为临床诊断和治疗指导平台，推动精准医学发展。